2015 Fiscal Year Research-status Report

アニサキス抗原の経口摂取とそれによるIgE抗体の産生はアレルギーに関与するのか？

Research Project

Project/Area Number	26460818
Research Institution	Osaka City Institute of Public Health and Environmental Sciences
Principal Investigator	阿部仁一郎大阪市立環境科学研究所, その他部局等, 研究員 (10321936)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	寺本勲 (木俣勲) 大阪市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (20153174)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	アニサキス / 抗原 / 特異抗体 / イムノブロット / 二次元電気泳動
Outline of Annual Research Achievements	アニサキス感作動物に同幼虫ホモジネートを経口投与した場合、抗体反応が増強される抗原分画の同定をイムノブロット法等で試みた。ホモジネート投与後に各抗体アイソタイプの反応性が増強した主要抗原分画のサイズは次の通りである：IgM抗体では約130kDa、50～75kDa、IgGとIgEでは約15kDa、35kDaであった。IgGとIgEで認識された両抗原分画はサイズから同一と推測された。15kDa、35kDaの分画は、沸騰浴中30分、115℃90分、121℃20分の加熱処理でも抗原性が失われなかった。また、酸およびペプシン処理によっても抗原性が保持されており、その耐性能は15kDa分画でより強かった。約35kDa分画の質量分析の結果から、同分画はアニサキスヘモグロビンである可能性が示されたが、それ以外の複数のタンパク質の混在も予想された。このため、二次元電気泳動とイムノブロットで陽性を示したスポットについて質量分析を試みたところ、それはアニサキスヘモグロビンであることが明らかとなった。このタンパク質はアニサキス感作に関わる慢性アニサキスアレルギー患者の抗体が認識するアレルゲンとしても知られていた。同様に約15kDa分画について質量分析を試みたところ、分類学的にアニサキスと近縁な犬回虫や豚回虫のミオフィリンタンパク質、アニサキスの9番目のアレルゲンAni s 9等が候補として示されたが、その特定には至らなかった。同分画の二次元電気泳動とイムノブロット解析から、SDS-PAGEで切り出された同分画には少なくとも可視的に8つのタンパク質が混在していると考えられ、そのイムノブロット解析から2つのスポットが抗体陽性を示し、特に一方のスポットは抗体の反応性が著明に強いことから、このスポットに含まれるタンパク質が約15kDaでの反応性に関わるタンパク質であると考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason アニサキス感作動物に同幼虫のホモジネートを経口投与した場合に、イムノブロット法でホモジネート投与後に抗体反応が増強された分画の中の主要2分画について、二次元電気泳動等でその分画・スポットの特定を試み、さらにその質量分析とMascot解析から当該スポットのタンパク同定を試みた。結果として、2分画中1分画については同定することができたが、抗原量が少ない割に抗体反応がより強く表れた他方の分画については、電気泳動後の可視的分画量が少なかったこと、それが低分子量であったこと、さらに同分画に複数のタンパクが混在している可能性があったことから明確な同定には至らなかった。
Strategy for Future Research Activity	アニサキス感作動物に同ホモジネートを経口投与した場合に、特異抗体反応が増強された主要2分画は、感作個体が死滅幼虫を摂取した際に何らかの免疫反応を誘導する可能性があり、それがアレルギーという形で発現することも予想される。分子量のサイズが小さいこと、少ない抗原量でも特異抗体が強く反応すること、熱・酸・ペプシン耐性があること等の点で、27年度に同定できなかった一方の抗原分画が、そのような病態発現に関与する可能性が高い。このため今後は、この抗原分画の同定を最優先とし、同定後は既に同定済みの約35kDa分画とともに、アニサキス感作動物にそれら抗原を経口投与し、実際に両抗原分画に対する特異抗体反応が増強されるのか、さらに何らかのアレルギー症状が発現するのかについて検討する。
Causes of Carryover	成果発表の寄生虫学会大会の交通費の支出をできるだけ抑えたため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	生じた次年度使用額約1万円については、今後の研究の推進方策等でも示した通り、抗原タンパクの受託同定の費用に充てる。