2015 Fiscal Year Research-status Report
胃食道接合部癌の幹細胞の同定と応用による治療法の開発
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26460934
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
平田 喜裕 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (10529192)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 伸三 公益財団法人朝日生命成人病研究所, その他部局等, 教授 (30723746)
山田 篤生 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (80534932)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 胃食道接合部 / 癌 / 幹細胞 / 分化誘導 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H26年度は、K19-cre; KrasG12D; TGFbR2 f/fマウスにタモキシフェンを投与し、胃食道接合部癌を作成した。腫瘍部では細胞増殖マーカーが高発現し、扁平上皮マーカーであるKRT1, KRT14、腺上皮の形質マーカーKRT7, KRT8の発現がみられた。さらに幹細胞のマーカーであるSOX2, SOX9, CD44などの分子の発現が増加しており、本モデルの接合部癌が扁平上皮と腺上皮、また幹細胞の形質を有することが示唆された。LacZ遺伝子を用いて腫瘍細胞の系譜追跡を行い腫瘍細胞はK19陽性細胞から発生していることを確認した。またこの接合部癌から二種類の癌細胞株を樹立した。
H27年度は樹立した癌細胞株を用いてオルガノイドを作成した。いずれの細胞株でも三次元培養が可能であり、腺管様の出芽形態を示した。これらのオルガノイドは単層の細胞で形成される正常のオルガノイドと異なり、重層しており扁平上皮様の形質が認められた。よって本研究で樹立した接合部癌の癌細胞株は扁平上皮と腺上皮の双方の形質を有していると考えられた。またこのオルガノイドもSOX9, CD44の幹細胞マーカーを発現していた。さらに分化誘導因子についてこの培養細胞株を用いて検討した。Wntシグナルリガンド、EGF、TGFbシグナルのリガンド、またそのアンタゴニストであるNogginなどで刺激し、イムノブロットやq-PCRを施行したが、扁平上皮マーカーp63、腺上皮マーカーMUC4ともに有意な発現変化は見られず、接合部癌の分化誘導因子はこれらのリガンド以外のものである可能性が示唆された。
またK19-cre; KrasG12D; TGFbR2 f/f; CDH1 f/fマウスを作成し、e-cadherin遺伝子の発癌への影響について検討した。このマウスにタモキシフェンを投与すると3w後にやはり接合部特異的に腫瘍が発生した。本腫瘍でも転移は認めず、組織型も同様であり、K19陽性細胞由来の接合部癌におけるe-cadherin遺伝子の影響は限定的であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウスの系統樹立、発癌モデルの解析はほぼ計画通りに進んでいる。また今年度は発生した癌細胞株からのオルガノイドの作成と解析を行った。現在までの刺激では特異的分化を促すシグナルを同定できていないため、今後さらなる薬剤をスクリーニングする予定である。本研究によってオルガノイドの標本を作り、その遺伝子発現を免疫染色で検討する実験系を確立した。
一方で、接合部癌幹細胞の起源細胞については引き続き検討中であるが、未だに幹細胞の同定には至っていない。K19-cre; KrasG12D; TGFbR2 f/fマウスを用いると接合部に限らず、胃粘膜全体が系譜追跡されてしまい、接合部特異的な幹細胞を指摘しえない。一方でK19-cre; TGFbR2 f/fマウス、K19-cre; Rosa-LacZマウスでは、接合部では系譜追跡される細胞が存在せず、KrasG12D+TGFbR2ノックアウトが腫瘍化には必要であると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
接合部特異的な系譜追跡のモデルとしてK19-cre; KrasG12D; Rosa-LacZマウスを樹立し検討する。また引き続き、サイトカインや細胞内シグナル阻害剤を用いてオルガノイドを刺激し、腺細胞、また扁平上皮細胞への分化を促す薬剤を探索する。
さらにK19-creマウス以外の胃粘膜もしくは食道粘膜の遺伝子改変マウスを用いて、接合部に腫瘍が発生する遺伝子の異常を明らかにする。具体的に正常接合部で発現を認めるLgr5-creマウスおよび胃粘膜上皮の内腔側に発現をみとめるTFF1-creを用いて系譜追跡と発癌について検討する。
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| Causes of Carryover |
研究室の移転によって一時的にPCRなどの実験が不可能となった期間が生じたため、一部試薬の購入を翌年度に行うこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の物品費として計上する。分子生物試薬の購入に充当する予定。
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