2015 Fiscal Year Research-status Report
Notchシグナル再活性化によるバレット食道の発癌・進展機序の解明
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26460937
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
石村 典久 島根大学, 医学部, 講師 (40346383)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バレット食道 / シグナル伝達 / Notch / Cdx2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
バレット食道腺癌の形成過程には、様々な分子シグナルが複雑に関与していることが明らかとなってきたが、まだ不明な点も多い。私共は食道扁平上皮からバレット食道、すなわち、腸上皮化生を形成する過程において、転写因子であるCdx2とNotchシグナルの相互作用が重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。今回は、バレット食道を背景とする腺癌の発生におけるNotchシグナルとCdx2の関連について評価し、発癌・進展に関わるNotchシグナルの役割を明らかにすることを目的として本年度は以下の成果を得た。
①Notchシグナル発現変化による増殖関連因子の発現調節
バレット食道細胞株（CP-A)、バレット腺癌細胞株（OE-19・33）を用いて、増殖抑制因子P27kip1および転写因子SOX9の発現変化を評価した。Cdx2が強く発現しているCP-Aにおいては、Notchリガンド刺激を行っても、P27kip1やSOX9の発現変化は軽度であったが、Cdx2の発現低下をきたしているOE-19・33においては、Notchリガンド刺激によってP27kip1の発現低下が著明となり、一方でSOX9の発現増強を認めた。さらにOE33にCdx2ベクターを導入すると、Notchリガンド刺激によるこれらの発現変化は抑制が見られた。
②Cdx2発現変化によるHes-1調節が細胞増殖能・浸潤能に与える影響
CP-A細胞にCdx2 shRNAを導入した系を作成し、細胞の増殖能の変化をMTS assayおよびBrdU assayを用いて評価しすると、Cdx2が抑制された系で有意な細胞増殖能の亢進を認めた。一方、OE33細胞にCdx2 shRNAを導入した系においては、増殖能および浸潤能の低下が見られ、Hes-1の発現変化との関連性が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで私共は、扁平上皮からバレット食道（腸上皮化生）を形成する段階において、胆汁酸刺激によるCdx2の発現亢進がNotchシグナルの下流の転写調節因子であるHes-1の発現をNotchレセプター非依存的に調節し、腸上皮化生の形成に重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。一方で、バレット腺癌においてはCdx2の発現低下とHes-1の発現亢進が認められており、発癌過程においてどのようにCdx2とNotchシグナルが関わっているかは、今まで明らかにされていなかった。今回は、バレット食道から腺癌の発癌機序におけるNotchシグナルとCdx2の関連を明らかにすることを目的としている。培養細胞での実験系において、胆汁酸刺激を行うとNF-kBを介してCdx2発現亢進をきたすことは過去に私共の教室で示しているが、胆汁酸の短期刺激によるCdx2とNotchシグナルの変化が生体におけるバレット食道での発癌機序と同一とは考えにくい。そこで、バレット食道腺癌組織におけるCdx2発現変化を評価すると一部ではCdx2のメチレーションが発現低下に関わっていることが示された。すなわち、バレット食道が形成されてCdx2の発現亢進をきたしている状態から、エピジェネティックな変化によってCdx2の発現が低下すると、Cdx2によるHes-1の抑制的な調節機序が破綻することによって、Notchシグナルが活性化され、Hes-1を介してP27kip1の発現低下や転写因子であるSOX9の発現亢進をきたす機序が想定される結果が得られている。胆汁酸の投与の条件設定が困難であったものの、当初予定していた実験計画をおおむね満たすものであると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの検討から、食道扁平上皮からバレット食道が形成される際のCdx2の発現亢進は、一方で発癌に関しては抑制的に作用していることが示された。Cdx2の発現低下しているバレット腺癌細胞株にCdx2を導入すると、増殖能や浸潤能が低下すること示されたが、これにNotchシグナルを亢進あるいは抑制させることで、細胞増殖・浸潤能へ与える変化を明らかにしていく。まずは、バレット食道および腺癌標本を用いて、癌の浸潤・転移に重要な因子である上皮間葉移行（EMT)に関連する因子（snail, slug, Twist, TGF-beta, E-cadherin）の発現の評価を免疫染色・リアルタイムPCRを用いて行う。続いて、培養細胞を用いて、リコンビナントNotchリガンドおよび、Notch IC domainのtransfectinを行い、Notchシグナルのgain of functionモデルを作成する。さらにNotchシグナル阻害薬であるγセクレターゼ阻害薬やHes-1 siRNAなどのNotchシグナルのloss of functionモデルを作成し、上記のEMT関連因子の発現変化を評価することでバレット腺癌の進展に関わる因子がNotchシグナルによって、どのように制御されているかを明らかにしていく予定である。予定通り、研究が推進されれば、さらにHes-1発現レベルの変化が、抗癌剤抵抗性機序に関わるかどうかについて、上記のNotchシグナルの機能変化実験系を用いて、5-FUやoxaliplatin投与による細胞のviabilityおよびアポトーシス抵抗性の評価を行い、Notchシグナル阻害薬投与によるHes-1発現低下が抗癌剤の効果を高めることができるかについても評価するところまで検討を進めていく。
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| Causes of Carryover |
本年度に使用した分子生物学的研究用の試薬や免疫染色用の抗体、プラスティック器具などについて購入費用を計上していたが、当研究室に保有のものを使用するなどして、必要量が少なくなり、購入に要する費用が予定よりも少なくなった。また、学会参加の旅費も他の研究費から支出することができたため、予定よりも少なくなったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度（最終年度）は培養細胞を中心とした検討を行う予定であり、特に上皮間葉移行（EMT)に関連する因子の評価を行うための各種試薬の購入費用、学会参加費および論文投稿費などに充てる予定である。
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Research Products
(33 results)
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[Journal Article] Similarities and differences among eosinophilic esophagitis, proton pump inhibitor-responsive esophageal eosinophilia, and reflux esophagitis: Comparisons of clinical, endoscopic, and histopathological findings in Japanese patients.2016
Author(s)
Jiao D, Ishimura N, Maruyama R, Ishikawa N, Nagase M, Oshima N, Aimi M, Okimoto E, Mikami H, Izumi D, Okada M, Ishihara S, Kinoshita Y.
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Journal Title
Journal of Gastroenterology
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Small Intestinal Bacterial Overgrowth in Patients with Refractory Functional Gastrointestinal Disorders.2016
Author(s)
Shimura S, Ishimura N, Mikami H, Okimoto E, Uno G, Tamagawa Y, Aimi M, Oshima N, Sato S, Ishihara S, Kinoshita Y
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Journal Title
Journal of Neurogastroenterology and Motility
Volume: 22
Pages: 60-68
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] No increase in gastric acid secretion in healthy Japanese over the past two decades.2015
Author(s)
Ishimura N, Owada Y, Aimi M, Oshima T, Kamada T, Inoue K, Mikami H, Takeuchi T, Miwa H, Higuchi K, Kinoshita Y
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Journal Title
Journal of Gastroenterology
Volume: 50
Pages: 844-851
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Prevalence of gastroesophageal reflux disease in children, adults, and elderly in the same community.2015
Author(s)
Okimoto E, Ishimura N, Morito Y, Mikami H, Shimura S, Uno G, Tamagawa Y, Aimi M, Oshima N, Kawashima K, Kazumori H, Sato S, Ishihara S, Kinoshita Y
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Journal Title
Journal of Gastroenterology and Hepatology
Volume: 30
Pages: 1140-1146
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Circumferential distribution and location of Mallory-Weiss tears: recent trends.2015
Author(s)
Okada M, Ishimura N, Shimura S, Mikami H, Okimoto E, Aimi M, Uno G, Oshima N, Yuki T, Ishihara S, Kinoshita Y
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Journal Title
Endoscopy International Open
Volume: 3
Pages: E418-424
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] LDN-193189, a BMP Type I Receptor Inhibitor, Reduces SMAD and p38MAPK Signaling and SOX9 Expression in Barrett’s Epithelial Cells: Potential Role for Canonical and Non-Canonical BMP4 Signaling in Barrett’s Pathogenesis2016
Author(s)
Tamagawa Y, Ding P, Gichinga MW, Ishimura N, Kinoshita Y, Spechler SJ, Souza RF, Wang DH
Organizer
DDW 2016
Place of Presentation
San Diego, USA
Year and Date
2016-05-22 – 2016-05-24
Int'l Joint Research
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[Presentation] Endoscopic characteristics of 59 Japanese eosinophilic esophagitis patients.2016
Author(s)
Okimoto E, Ishmura N, Izumi D, Mikami H, Aimi M, Tanimura T, Oshima N, Ishihara S, Adachi K, Kinoshita Y
Organizer
The 9th IGICS
Place of Presentation
Tokyo, Japan（京王プラザホテル）
Year and Date
2016-02-27 – 2016-02-27
Int'l Joint Research
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[Presentation] Usefulness of CO2 enterography during double-balloon enteroscopy assisted endoscopic retrograde cholangiopancreatography.2015
Author(s)
Moriyama I, Fukuba N, Sonoyama H, Tada Y, Oka A, Mishiro T, Oshima N, Tobita H, Yuki T, Kawashima K, Miyaka T, Ishimura N, Sato S, Ishihara S, Kinoshita Y
Organizer
DDW 2015
Place of Presentation
Washington, USA
Year and Date
2015-05-18 – 2015-05-18
Int'l Joint Research
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[Presentation] BMP4 induces SOX9 and columnar cytokeratin expression in esophageal squamous cell and increases proliferation in Barrett’s cells through the p38MAPK pathway: potential roles for BMP4-p38MAPK signaling in Barrett’s pathogenesis and carcinogenesis.2015
Author(s)
Tamagawa Y, Ding P, Zhang Q, Pham TH, Cheng E, Ishimura N, Kinoshita Y, Spechler SJ, Souza RF, Wang DH
Organizer
DDW 2015
Place of Presentation
Washington, USA
Year and Date
2015-05-16 – 2015-05-16
Int'l Joint Research
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[Presentation] ⊿Np63 upregulates expression of squamous cytokeratins and increases proliferation in squamous cells, but decreases proliferation in Barrett’s cells: a potential role for downregulation of ⊿Np63 in Barrett’s pathogenesis.2015
Author(s)
Tamagawa Y, Ding P, Zhang Q, Pham TH, Cheng E, Ishimura N, Kinoshita Y, Spechler SJ, Souza RF, Wang DH
Organizer
DDW 2015
Place of Presentation
Washington, USA
Year and Date
2015-05-16 – 2015-05-16
Int'l Joint Research
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