2014 Fiscal Year Research-status Report

上部消化管における新規胆汁酸センサーの機能解析

Research Project

Project/Area Number	26460946
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	鹿野美千子名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (70405190)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	神谷武名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (10254301) 植田高史名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90244540)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	生体分子 / 上部消化管 / 食道 / 胆汁酸センサー
Outline of Annual Research Achievements	1.今年度は消化管における新規胆汁酸センサー候補ASIC5の発現をRT-PCRと免疫染色で調べた。試料としてC57Bl/6J野生型マウスの食道、胃、十二指腸、肝臓などを用いた。RT-PCRでは、この遺伝子が発現していないという心臓、脳、逆転写していないRNAを陰性コントロールとして使用した。免疫染色では陰性コントロールとして吸収ペプチドを用いた。再現性の確認や個体差を考慮していずれも５回以上繰り返した。その結果、RT-PCRでは、最初は結果が安定せず再現性に欠けていたが、プライマーを変えたところ、コンスタントに食道、胃、十二指腸、肝臓に注目している遺伝子の断片が観察できた。免疫染色では、食道、十二指腸、胆嚢において、その粘膜上皮に明らかな当該胆汁酸センサー候補タンパクの発現を確認できた。並行して免疫染色に用いた抗体にてウエスタンブロットも行っているが、まだしっかりとしたデータを得るに至っていない。さらにin situ hybridizationを実施するためのプローブ作製も行った。 2.食道上皮細胞は、酸性下にて胆汁酸に暴露されると、細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こす。そこで、消化管における新規胆汁酸センサー候補ASIC5をクローニングしてpcDNA3.1+哺乳細胞発現ベクターに組み込み、CHO-K1細胞に発現させてASIC5の胆汁酸に対する応答性をカルシウムイメージングで検討している。現在までに判明したことは、CHO-K1細胞自体が、酸性下では胆汁の主成分であるデオキシコール酸やケノデオキシコール酸に応答している可能性があり、並行してこの解析を継続するとともに、別の系での解析を検討している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 胆汁酸成分はそれ自体に界面活性作用があることがわかった。これは細胞に対して非特異的な刺激応答をもたらす可能性があり、生理学的解析に遅れが生じている。遺伝子発現の解析は、すべての方法において矛盾のない結果が得られて実験終了となる。当教室のルティンの発現解析実験では結果に複数の矛盾点が確認されたため、予定になかった解析や抗体など試薬の購入評価に時間がかかり遅れが生じている。
Strategy for Future Research Activity	1.機能解析について；胆汁酸成分のうち、ケノデオキシコール酸はラットのASIC5を活性化することが知られているので、これを解析できる系を立ち上げて、その他の実験を進めていく。また電気生理の解析も並行して進めていく、現在稼働中のアフリカツメガエル卵母細胞を用いた解析方法に加えて、稼働はしていないが、設備は整っているパッチクランプ法においても解析を進める。 2.発現解析について；RT-PCR、免疫染色の結果は大まかには一致しているので、この結果に間違いがないかを、in situ hybridization法、ウエスタンブロット法にて確認する。 3.マウス解析；GERDのモデルマウスをコンスタントに作製できるよう準備を整える。
Causes of Carryover	当初考えていたよりも免疫染色に使用した抗体の質が高く、いろいろなメーカーの抗体を購入する必要がなったことと、機能解析において、十分な解析系が確立できず、選択的アゴニストやブロッカー、siRNAなどの試薬を購入しなかったことによる。
Expenditure Plan for Carryover Budget	現在ウエスタンブロットでの解析を行っている。抗体は免疫染色で良好でも、ウスタンブロットではよくない場合があり、両実験でコントロールがとれ使用できる抗体を購入することに使用する。また残金が発生した場合には、選択的アゴニストやブロッカーの購入に充てる。