制御性B細胞の誘導・活性化機構の分子メカニズムの解明と腸管炎症制御への応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460970
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 石原 俊治 島根大学, 医学部, 准教授 (80263531)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 制御性B細胞 / 炎症性腸疾患 / 腸管免疫 / アポトーシス / IL-10

Outline of Annual Research Achievements

私共は、炎症性腸疾患（IBD）モデルマウス（クローン病自然発症モデルSAMP1/Yitマウス、SCIDマウスへのナイーブT細胞移入腸炎モデル）を用いて、IBDの病態における制御性B細胞（Breg）の機能を報告した（Immunology 2010, Inflamm Bowel Dis 2014）。これらの研究成果を踏まえて、その後は、生体内におけるBregの誘導・活性化機構を中心に研究を進めてきた。それらの研究において、体外で実験的に調整したアポトーシス細胞（胸腺細胞）を腸炎モデル（T細胞移入SCIDマウス）に経静脈的に移入することで腸炎抑性が可能になること、さらに、アポトーシス細胞の移入がBregの誘導・活性化を介して抗炎症効果（腸炎抑制）を誘発することが明らかとなった（Inflamm Bowel Dis 2014）。一方、B細胞はB細胞受容体（BCR）や核酸認識Toll様受容体（Toll-like receptor-9; TLR9）などを介して、自己抗原認識することが知られ、このシステムが免疫寛容誘導に貢献していることが明らかとなっている（Tiller. Immunity. 2007）。2015年度は、アポトーシス細胞から遊離または細胞表面に表出されるDNA-クロマチン複合体の認識を介したBregの活性化を、野生型およびTLR9 KOマウスの脾臓B細胞とアポトーシス細胞の共培養系で検討してきた。その結果、アポトーシス細胞によるBreg誘導は、TLR9を介したシグナルに依存することが明らかとなった。現在は、TLR9を介したBreg誘導メカニズムをヒトのIBD治療へ応用すべく新規のモデル開発をおこなっている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Bregを生体内で誘導するメカニズムの解明を中心に研究を進めてきた。2014年度までの研究成果で、アポトーシス細胞を生体内に体外から移入することで抗炎症効果が得られるという知見を得ていたが、その詳細なメカニズムは不明であった。2015年度の研究成果によって、体外から移入したアポトーシス細胞がレシピエントの脾臓でBregを誘導・活性化すること、その過程にはアポトーシス細胞から遊離または細胞表面に表出されるDNA-クロマチン複合体を認識するTLR9シグナルが重要であることが明らかとなった。これらの結果は、いずれもこれまでに報告のなかった新知見であり、今後、Bregの臨床応用を考える上で有意義な研究成果である。以上の進行状況から、2015年度までの申請課題の達成度は比較的順調であると考えている。

Strategy for Future Research Activity

１）食細胞によるアポトーシス細胞の貪食によって免疫寛容が誘導される（Hanayama. Science. 2004）。この系におけるBreg活性化を、貪食機能が欠失したマウス（Milk fat globule-EGF factor-8 KO; MFG-E8 KO）を用いた腸炎モデルと、分離した脾細胞とアポトーシス細胞の共培養系で証明する。
２）ヒトBregの誘導・活性化機構の解明とIBDの病態への関与を明らかにする。IBDへの治療応用を念頭に置いた場合、ヒトにおいて同様のBreg誘導機構が存在することを検証することは不可欠である。ヒトのBreg分画であるCD1dhighCD19highあるいはCD24highCD38high B細胞を健常人の末梢血ら分離してアポトーシス細胞の共培養系でBreg活性化を確認する。さらに、クローン病および潰瘍性大腸炎患者の末梢血B細胞で同様の検討をおこない病態への関与を検討する。

Causes of Carryover

2015年に進めた研究は、2014年度までの研究の研究成果をさらに基礎的に解明し、臨床応用していくというものであり、研究内容は継続的なものとなっている。したがって、実験動物（ SCIDマウス）の使用、分子生物学的試薬、各種抗体、プラステイックデイスポ製品の使用についても、これまでの研究結果をもとに無駄なく購入、使用することができたことが次年度使用額の生じた理由と考えている。また、遺伝子操作マウスについても、MFG-E8 KOやTLR9 KOマウスは、当研究室の他の研究課題でも使用されてきたことから、経費の分担の点で効率的であった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

2016年度は、MFG-E8 KOを用いた実験、さらに、ヒトのIBD患者の末梢血を用いてin vitroにおけるBregの誘導・活性化機構の詳細を検討していく予定である。したがって、動物（野生型）の購入費用、分子生物学的試薬、各種抗体、プラステイックデイスポ製品は必要であり、その部分に残費用を充てるとともに2016年度の予算も効率的に使用していきたい。研究成果については、2017年2月の国際学会で発表する予定であり、旅費や準備費などにも予算を充てていく予定である。

Research Products

• [Journal Article] Fecal calprotectin level correlated with both endoscopic severity and disease extent in ulcerative colitis (2016)
  • Author(s): Kawashima K, Ishihara S, Yuki T, Fukuba N, Oshima N, Kazumori H, Sonoyama H, Yamashita N, Tada Y, Kusunoki R, Oka A, Mishima Y, Moriyama I, Kinoshita Y
  • Journal Title: BMC Gastroenterology Volume: 16 Pages: 47
  • DOI: 10.1186/s12876-016-0462-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Therapeutic Efficacy of pH-Dependent Release Formulation of Mesalazine on Active Ulcerative Colitis Resistant to Time-Dependent Release Formulation: Analysis of Fecal Calprotectin Concentration (2016)
  • Author(s): Kawashima K, Ishihara S, Yuki T, Onishi K, Kushiyama Y, Fujishiro H, Miyaoka Y, Yuki M, Komazawa Y, Tanimura T, Sonoyama H, Tada Y, Kusunoki R, Oka A, Fukuba N, Oshima N, Moriyama I, Kinoshita Y
  • Journal Title: Biomed Res Int Volume: 2014 Pages: 342751
  • DOI: 10.1155/2014/342751
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Decreased Frequency of Intestinal Regulatory CD5+ B Cells in Colonic Inflammation (2016)
  • Author(s): Mishima Y, Ishihara S, Oka A, Fukuba N, Oshima N, Sonoyama H, Yamashita N, Tada Y, Kusunoki R, Moriyama I, Yuki T, Kawashima K, Kinoshita Y
  • Journal Title: PLoS One Volume: 11 Pages: e0146191
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0146191
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Down-regulation of serotonin reuptake transporter gene expression in healing colonic mucosa in presence of remaining low grade inflammation in ulcerative colitis (2016)
  • Author(s): Tada Y, Ishihara S, Kawashima K, Fukuba N, Sonoyama H, Kusunoki R, Oka A, Mishima Y, Oshima N, Moriyama I, Yuki T, Ishikawa N, Araki A, Harada Y, Maruyama R, Kinoshita Y
  • Journal Title: Journal of Gastroenterology and Hepatology Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/jgh.13268
• [Journal Article] Role of milk fat globule-epidermal growth factor 8 in colonic inflammation and carcinogenesis (2015)
  • Author(s): Kusunoki R, Ishihara S, Tada Y, Oka A, Sonoyama H, Fukuba N, Oshima N, Moriyama I, Yuki T,Kawashima K, Ansary MM, Tajima Y, Maruyama R, Nabika T, Kinoshita Y
  • Journal Title: J Gastroenterol. Volume: 50 Pages: 862-875
  • DOI: 10.1007/s00535-014-1036-x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An open-label prospective randomized multicenter study of intensive versus weekly granulocyte and monocyte apheresis in active crohn's disease (2015)
  • Author(s): Yoshimura N, Yokoyama Y, Matsuoka K, Takahashi H, Iwakiri R, Yamamoto T, Nakagawa T, Fukuchi T, Motoya S, Kunisaki R, Kato S, Hirai F, Ishiguro Y, Tanida S, Hiraoka S, Mitsuyama K, Ishihara S, Tanaka S, Otaka M, Osada T, Kagaya T, Suzuki Y, Nakase H, Hanai H, Watanabe K, Kashiwagi N, Hibi T
  • Journal Title: BMC Gastroenterology Volume: 15 Pages: 163
  • DOI: 10.1186/s12876-015-0390-3
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Psychological state of subjects with irritable bowel syndrome and headache: annual health check-up survey results (2015)
  • Author(s): Kawashima K, Ishihara S, Uemura Y, Kazumori H, Katsube T, Sonoyama H, Tada Y, Kusunoki R, Oka A, Fukuba N, Oshima N, Yuki T, Kinoshita Y
  • Organizer: Digestive Disease Week 2015
  • Place of Presentation: Washington, USA
  • Year and Date: 2015-05-17 – 2015-05-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Fecal calprotectin concentration correlated with both endoscopic severity and disease extent in ulcerative colitis: Analysis of sum of Mayo endoscopic subscore for five colon segments (2015)
  • Author(s): Kawashima K, Ishihara S, Yuki T, Sonoyama H, Tada Y, Oka A, Kusunoki R, Fukuba N, Oshima N, Moriyama I, Kinoshita Y
  • Organizer: Digestive Disease Week 2015
  • Place of Presentation: Washington, USA
  • Year and Date: 2015-05-17 – 2015-05-17
  • Int'l Joint Research