2015 Fiscal Year Research-status Report
肝細胞における腫瘍免疫標的分子発現制御機構のiPS細胞を用いた解明と創薬への展開
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26461004
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
青井 貴之 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00546997)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
青井 三千代 (小柳) 神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (90432327)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 肝細胞 / 免疫 / C型肝炎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ヒトiPS細胞からの肝細胞への分化誘導技術やiPS細胞の遺伝子改変技術等を駆使することによって、ヒト非癌肝細胞へのウイルス感染に惹起される免疫標的分子の発現制御機構を包括的に明らかにし、それをターゲットとする創薬へと展開するための系を確立することを目的とし、本年度は以下の内容を実施した。
【C型肝炎ウイルスタンパクを発現させたヒトiPS細胞由来肝細胞における既知の免疫標的分子の発現変動の評価系確立と評価】
今年度は、HCVコアタンパク遺伝子を、tet-onシステムを搭載したpiggyBacベクターを用いて、ヒトiPS細胞に導入し、これを肝細胞へ分化させた細胞（AFP陽性、アルブミン陽性を確認）を用いて実験を行った。NK細胞やγδT細胞など、非特異的腫瘍免疫の標的分子として既知のものであるMICA、MICB、ULBP１～４等について、RT-PCRによるmRNA発現量の評価を行った。これらの内のあるものが、コアタンパクの強制発現により発現誘導されることが分かった。
また、非特異的腫瘍免疫の標的分子のタンパク質レベルでの発現を、フローサイトメトリーで評価し、セルソーターで回収するための系を確立した。この系を用いて評価したところ、コアタンパクの強制発現により、mRNAの発現上昇がみられた遺伝子において、タンパク質発現上昇も見られることが明らかになった。また、コアタンパクの強制発現が起こっているにも関わらず、当該免疫標的分子の発現上昇がみられない細胞と、みられる細胞を比較するために、生細胞をソーティングする必要が考えられた。そこで、ヒトiPS細胞由来肝細胞培養を、培養皿から剥離し分散する条件を検討し、十分な生存率が得られる条件を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度はC型肝炎ウイルスタンパクを発現させたヒトiPS細胞由来肝細胞における既知の免疫標的分子の発現変動の評価系確立と評価に注力した。前年度までに、肝細胞の分化誘導系が確立していたが、本年度の中盤以降、分化誘導系が安定にワークしなくなってしまった。その原因の同定と解決に時間を要したために、進捗は当初計画よりもやや遅れた。しかし、この問題は年度後半には解決することができ、以後は研究は加速度的に進捗している。また、FACSの系の確立の見込みがたったことにより、当初計画していたレポーターシステムを構築することなしに、本研究の目的である、免疫標的分子の発現制御機構の解明を進めることができることが分かった。このことは、研究の速度を上げる要因となると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
HCVコアタンパク質が発現している状況で、免疫標的分子の発現上昇がみられる細胞とみられない細胞の比較を行う。これによって、免疫標的分子の発現誘導する機構やそれを抑制する機構について明らかにしていく。当初は、発現変動が認められた免疫標的分子をコードする遺伝子についてレポーターシステムを構築する計画であった。しかし、H27年度の成果により、目的分子に対する抗体を用いたフローサイトメトリーおよりセルソーティングをうまく稼働するようになった。そこで、研究の効率的な推進のために、当初計画を一部変更し、レポーターシステムの構築は行わずに、ソーティングした細胞同士を、マイクロアレイなどで比較し、差のある遺伝子に着目して、免疫標的分子の発現制御機構の探索を進めることとする。具体的には、マイクロアレイ等で差がみられた遺伝子について、遺伝子の強制発現やノックダウン、阻害剤の投与などによる影響を調べる。また、それらの遺伝子のプロモーター領域の配列から結合が予測される転写因子の変動に着目して同様の実験を行う。さらに、当該遺伝子が転写因子である場合には、ルシフェラーゼアッセイやクロマチン免疫沈降を行うことでそのターゲット領域を同定する。
このようにして発現制御機構が明らかになれば、その機構の中で中心的役割を果たす分子を明らかにし、それを標的とした創薬へと展開する。
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