2014 Fiscal Year Research-status Report
C型慢性肝炎ウイルスによる脂質代謝異常に対するmiRNAsの関与の解明
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26461014
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
斉藤 聡 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (00275041)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中島 淳 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30326037)
今城 健人 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (30600192)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | C型肝炎 / ウイルス / miRNAs |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HCV遺伝子型1bのOR6アッセイシステムを用いる。このレプリコンシステムで複製増殖させたHCV複製増殖細胞(OR6)とコントロール細胞(HCV複製増殖細胞からインターフェロン（IFN）によりウイルスを完全に除去した細胞:OR6c)を用いてTotal RNAを抽出し，Real time PCR(TaqMan Micro RNA Assays)でmiRNAを定量する．①本研究では生体内では利用できる豊富な脂質が存在するが，これを再現するためにオレイン酸100μMを培地に添加してまずmiR-33bの発現を比較したが，両者の間に有意な差は認めなかった．②in vivoの状況を比較するためにC型肝炎患者２名の生検検体と，非C型肝炎患者の検体におけるmiR-33bの発現量を比較検討した．生体におけるmiRNAに有意差は認めなかった．③OR6細胞にmiR-33b mimic（内在性miR-33bの配列で，miR-33bが増加した状態を示す）をトランスフェクションしたところ，HCVのコア蛋白（構造領域），NS3（非構造領域）の発現の低下を認めた．このことはmiR-33b mimicがHCV複製を抑制することが示された．④miR-33b inhibitor（miR-33bと結合しmiR-33bの発現を抑制する）をトランスフェクションしたところHCV複製には影響を与えなかった．
SREBP1はHCV感染により発現が更新することが知られているが，今回の結果からはmiR-33bの発現レベルはHCVタンパクが発現している状態と，発現していない状態では有意差を認めず，miR-33b inhibitorの抗ウイルス作用は期待できないことが明らかとなった．一方，当初の予想に反しmiR-33b mimicでHCV複製が抑制されたことから，今後この機序を検討する．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現段階では達成度はやや予定より遅れている．当初miR-33bはSREBP1と共同して脂質代謝をコントロールすることから，HCV感染状態ではSREBP1と同様にmiR-33bは発現更新であることを予測していた．残念ながら有意差がなかったことから当初の予想とは異なっていた．細胞培養の培地に脂質を加えることで状況が変わるか否かの条件設定で時間が必要であった．最終的に培地の脂質濃度に関わらず，またHCVタンパクの発現の有無によらずmiR-33bの発現濃度に有意差は認めなかった．一方，miR-33b1の阻害薬はHCVの発現が抑制されることが新たに示された．これを使用することでmiR-33b阻害剤を用いることでHCV複製のコントロールが可能かを検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに脂質代謝に関与するmiR-33bを中心に検討したが，同様の条件でmiR-27やmiR-30を用いてみR-33bと同様の検討を行う．またパイロット的にmiR-33bで行ったが，C型肝炎患者の肝生検検体とコントロール検体で，Real time PCR(TaqMan Micro RNA Assays)でmiRNAの発現程度について検討する．コントロールとしてC型肝炎以外の慢性肝疾患(B型肝炎や，自己免疫性肝炎など)患者の肝生検検体を用いる本研究ではmiRNA-27，30，33をターゲットとしている．それぞれMicrosomal Triglyceride Protein (MTP)，SREBP1などに影響し脂質代謝に影響を及ぼすが，HTGLに対する反応は未知である．予想に反した場合には，他のmiRNAのスクリーニングを行う必要がある．またHTGLに対し影響が認められない場合には，HCVの複製のコントロール可能なmiRNAを見出すことを中心とする．
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