新規の遺伝子網羅的解析法による肝細胞癌分子標的薬に対する薬剤耐性遺伝子の同定

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461019
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 阿部 雄太 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (70327526)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 肝細胞癌 / ソラフェニブ / 薬剤耐性

Outline of Annual Research Achievements

１）Transposon tagged cellの確立：トランスポゾンを用いて肝癌細胞株であるHepG2、HepG3、LTRLのそれぞれのゲノム上のランダムな位置に、CMVのプロモータ領域と抗生剤のピューロマイシン耐性遺伝子を導入した。次にピューロマイシンによるselectionをかけることで、CMVのプロモータ領域が挿入された各種肝癌細胞群を樹立した。
２）薬剤耐性株の獲得：MTT assay法により薬剤至適濃度を確認した後、樹立したtransposon tagged cellを用いて、ソラフェニブを添加した。その結果コロニー形成を確認、そのコロニーはCMVプロモータ領域の導入により薬剤耐性に関与する遺伝子を過剰発現している可能性のある細胞株と考えられる。とくに我々は前述した肝癌細胞株のうちHepG2のtransposon tagged cellに対して、ソラフェニブを添加し、約１０個のソラフェニブ耐性コロニー樹立に成功した。
３）薬剤耐性遺伝子の同定：耐性コロニーを単離培養した後DNAを抽出し、トランスポゾンにより挿入された箇所を制限酵素処理にて切り出し、Splinkerette PCRにてDNAを増幅させ、プラスミドベクターを用いて大腸菌内でさらに増幅させた。続いて、増幅したDNAの塩基配列を同定し、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)を用いて遺伝子を同定した。複数の耐性コロニーで共通して発現している遺伝子がいくつか同定され、これは投与薬剤に対する耐性遺伝子の候補と考えた。
４）同定した薬剤耐性遺伝子の選定は、NEXTBIO RESEARCH社のNextBio database systemを用いて行う。本システムを用いて、候補遺伝子の発現と対象薬剤を用いた臨床試験の結果を対比し、膨大な遺伝子リストから次の実験を行う遺伝子を選定する予定である

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

様々な試料の不安定要素などで時間を要した細胞株の再選定や絞り込みののちに、ようやくソラフェニブに対する耐性遺伝子候補を複数選定するまでに至った。なお同時にソラフェニブ以外の薬剤についても検討を進めておりこれらも耐性遺伝子候補を得ている。こ

Strategy for Future Research Activity

今年度に同定した薬剤耐性遺伝子の選定を予定している。選定は、NEXTBIO RESEARCH社のNextBio database system (http://www.nextbio.com)を用いて行う予定である。このデータベースは臨床試験におけるマイクロアレイデータを蓄積し、さらに各遺伝子の発現と臨床データを容易に対比することが可能である。本システムを用いて、候補遺伝子の発現と対象薬剤を用いた臨床試験の結果を対比し、膨大な遺伝子リストから次の実験を行う遺伝子を選定する。