肝疾患とオートファジーによる細胞内小器官分解

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461020
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 山科 俊平 順天堂大学, 医学部, 准教授 (30338412)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上野 隆 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10053373)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: オートファジー / ミトコンドリア / 小胞体 / リソソーム / 慢性肝炎

Outline of Annual Research Achievements

肝疾患モデルマウスから単離した肝細胞内小器官における蛋白発現変化の解析

肝疾患モデル（脂肪性肝炎）とコントロールマウスからの単離肝細胞に脱共役剤CCCPを添加し、ミトコンドリア膜電位消失を誘導後にそれぞれの肝細胞よりミトコンドリアを単離した。2次元電気泳動によって発現蛋白変化を解析したところ両細胞間で発現変化する蛋白が複数検出された。現在、MS解析を行い発現変化蛋白の同定を行っている。また、これら蛋白群のphostag-アガロースゲルを用いた電気泳動解析を行い、リン酸化蛋白の同定を行っている。HCVレプリコン導入細胞と非導入細胞においても同様の検討を行っている。
一方、脂肪性肝炎モデルマウスとコントロールマウスの肝組織よりパーコール遠心法によってリソソームを単離し、iTRAQ蛋白解析と２次元電気泳動を行い、発現蛋白解析を行ったところ、ミトコンドリアがリソソーム・オートファジーに取り込まれてしまうため、ミトコンドリア蛋白の混入が生じリソソーム蛋白発現の解析が困難であることがわかった。肝組織ホモジネートに塩化カルシウムを処置し、リソソーム比重を軽量化し、ミトコンドリアとの比重差を拡大することによって単離リソソームの純度を上げる方法を試みたがミトコンドリアの混入は避けられなかった。現在、リソソーム単離ではなくリソソーム膜蛋白抽出に手技を変更し、ミトコンドリア蛋白の混入に関して解析を行っている。ミトコンドリア蛋白の混入が少ないなら蛋白解析に移行する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ミトコンドリア解析においてはほぼ当初の計画通りであるが、リソソーム蛋白解析においてミトコンドリアの混入が問題となったためリソソーム蛋白抽出の方法を変える必要があった。

Strategy for Future Research Activity

リソソーム蛋白解析においては、リソソーム単離からリソソーム膜蛋白抽出に変更し、発現蛋白解析を行う方策とした。細胞内小器官における発現変化する蛋白群が同定されてきているので、蛋白リン酸化の有無とその役割についてデーターベースを使用し明らかとしてゆく方針である。

Causes of Carryover

ミトコンドリア蛋白混入によってリソソーム蛋白解析が充分に行えなかったため使用予定額が減ってしまった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

現在、リソソーム単離からリソソーム膜蛋白抽出に解析物を変更し、解析を行う予定となっており、昨年度使用できなかった解析費用は今年度に使用する予定となっている。