C型肝炎ウイルスの粒子形成・分泌機構の解明と関与する細胞性因子の解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461021
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 森川 賢一 北海道大学, 大学病院, 助教 (60384377)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: C型肝炎ウイルス / ウイルス粒子形成 / ウイルス分泌 / GPｘ８ / HCVNS3-4Aプロテアーゼ

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的：近年HCV非構造（NS）蛋白3-4Aプロテアーゼがいくつかの細胞性宿主因子を標的とする事により、HCVの持続感染や病原性に関与していることが示唆されている。我々は、世界に先駆けてGPx8がHCVのNS3-4Aプロテアーゼにより切断される細胞性因子であり、GPx8はHCVの粒子形成・分泌に必須であると報告した。しかし、どのようにHCV粒子の形成が行われ分泌されていくのか、そこへGPx8がどのように関与しているのか、詳細な分子機構については解明されておらず、HCV粒子形成・分泌阻害をターゲットにした創薬開発も進んでいない。そこで、本研究ではHCV粒子形成・分泌へのGPx8関与のメカニズム解明に取り組むことにより、HCVの粒子形成機構、分泌機構、病原性発現機構を分子レベルで解明し、宿主因子をターゲットにした新たな抗ウイルス薬開発の基盤形成を目指す。

研究計画：平成26年度
A.GPx8および変異体選択的発現調整細胞株、恒常的GPx8ノックダウン細胞株の作成：テトラサイクリントランスアクチベーター（tTA）を利用したTet-offの系を利用し、U2-OS細胞またはHuh7細胞を元にGPx8およびその変異体（例：活性中心を不活化したもの、あらかじめHCV NS3-4Aプロテアーゼに切断された領域しか持たないもの等）を下流にもつプラスミドを遺伝子導入し、発現調整可能な安定細胞株を樹立した。これらの細胞株は、培養上清のテトラサイクリンの有無によりGPx8の発現を厳密に制御する事が可能となる。これらのGPx8は、内在性GPx8の影響を除外できるようsiRNA耐性の遺伝子変異を挿入し用いる。現在恒常的GPx8ノックダウン細胞株の作成にはレンチウイルスベクターを用いてshRNAにより作成中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

年度途中の2014年10月より所属研究機関を異動したため、実験室の引越しや物品の移動、新規研究室での実験系の立ち上げや確認作業のため当初の予定よりも若干遅延が出ているが、十分挽回可能と考える。

Strategy for Future Research Activity

研究計画：平成27年度以降；B. 作成した細胞株へのHCV感染実験：作成したGPx8およびその変異体発現調整細胞株を培養液中のテトラサイクリンの有無により、蛋白非発現群と発現群に調整する。恒常的GPx8ノックダウン細胞株とコントロールshRNAを用いた細胞株の比較検討も同様に行う。；C. 候補蛋白の抽出：FLAG tag化したGPx8蛋白発現調整細胞株を培養液中のテトラサイクリンの有無により、蛋白非発現群と発現群に調整する。HCVccを感染させた後、抗FLAG tag抗体を用いて免疫沈降によりウイルス粒子形成、および分泌に関与する蛋白を抽出する。；D. 候補蛋白の解析：免疫沈降で得たサンプルをプロテオーム解析を行い同定する。；E. 同定蛋白の機能解析：同定された蛋白を分子生物学的、生物学的種手法を用いて機能解析を行う。①レンチウイルスベクターを用いて標的蛋白強発現細胞を作製し、ウイルス粒子形成および分泌への関与を解析する。②siRNAを使用し、標的蛋白を欠損させウイルス粒子形成および分泌への関与を解析する。③HCVサブジェノミックレプリコンシステムを用いて標的蛋白のHCV複製への影響を解析する。④HCVccを使用することにより、標的蛋白のHCVの生活環への関与を各段階毎に詳細に解析する。

Causes of Carryover

年度途中の2014年10月より所属研究機関を変更したため、当初の研究計画よりも若干遅延が出ているため、予算執行も同様になった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

遅延分をH27年度に行うために、恒常的GPx8ノックダウン細胞株の作成にレンチウイルスベクターを用いてｓｈRNAにより作成する。

Research Products

• [Journal Article] Hepatitis C virus variants resistant to macrocyclic NS3-4A inhibitors subvert IFN-β-induction by efficient MAVS cleavage. (2014)
  • Author(s): Welsch C, Haselow K, Gouttenoire J, Schneider M, Morikawa K, Martinez Y, Susser S, Sarrazin C, Zeuzem S, Antes I, Moradpour D, Lange CM.
  • Journal Title: Journal of Hepatology Volume: 62(4) Pages: 779-784
  • DOI: 10.1016/j.jhep.2014.11.009.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Vitamin D Receptor and Jak-STAT Signaling Crosstalk Results in Calcitriol-Mediated Increase of Hepatocellular Response to IFN-α. (2014)
  • Author(s): Lange CM, Gouttenoire J, Duong FH, Morikawa K, Heim MH, Moradpour D.
  • Journal Title: Journal of Immunology Volume: 192(12) Pages: 6037-6044
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1302296.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Quantitative proteomics identifies the membrane-associated peroxidase GPx8 as a cellular substrate of the hepatitis C virus NS3-4A protease. (2014)
  • Author(s): Morikawa K, Gouttenoire J, Hernandez C, Dao Thi VL, Tran HT, Lange CM, Dill MT, Heim MH, Donzé O, Penin F, Quadroni M, Moradpour D.
  • Journal Title: Hepatology Volume: 59(2) Pages: 423-433
  • DOI: 10.1002/hep.26671.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 当院におけるGenotype 1b高ウイルス量C型慢性肝炎に対するLedipasvir/Sofosbuvir±Rivavirin併用療法の治療成績. (2015)
  • Author(s): 須田剛生, 小川浩司, 伊藤 淳, 佐藤史幸, 常松聖司, 佃 曜子, 寺下勝巳, 中井正人, 荘 拓也, 森川賢一, 夏井坂光輝, 坂本直哉.
  • Organizer: 第116回日本消化器病学会北海道支部例会.
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2015-03-07 – 2015-03-07
• [Presentation] Genotype 2型C型慢性肝炎に対するSofosbuvir/Rivavirin併用療法の治療成績. (2015)
  • Author(s): 小川浩司, 伊藤 淳, 常松聖司, 佐藤史幸, 寺下勝巳, 佃 曜子, 中井正人, 荘 拓也, 須田剛生, 森川賢一, 夏井坂光輝, 坂本直哉.
  • Organizer: 第116回日本消化器病学会北海道支部例会.
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2015-03-07 – 2015-03-07
• [Presentation] 肝移植後のC型慢性肝炎に対しシメプレビルを含む3剤併用療法を施行した4症例. (2015)
  • Author(s): 伊藤 淳, 常松聖司, 佐藤史幸, 佃 曜子, 寺下勝巳, 中井正人, 荘 拓也, 須田剛生, 夏井坂光輝, 森川賢一, 小川浩司, 坂本直哉.
  • Organizer: 第116回日本消化器病学会北海道支部例会.
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2015-03-07 – 2015-03-07
• [Presentation] 肝硬変における液性免疫異常. (2014)
  • Author(s): 土肥弘義, 森川賢一, 吉田 仁.
  • Organizer: 第40回日本肝臓学会東部会.
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都・新宿区）
  • Year and Date: 2014-11-28 – 2014-11-28
• [Presentation] 当院で経験したB型肝炎ウイルス再活性化９症例の検討. (2014)
  • Author(s): 大森里紗、森川賢一、林栄一、荒井 潤、梶原 敦、宮下みゆき、魚住祥二郎、下間 祐、打越 学、土肥弘義、坂木 理、吉田 仁.
  • Organizer: 第40回日本肝臓学会東部会.
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都・新宿区）
  • Year and Date: 2014-11-28 – 2014-11-28
• [Presentation] C型慢性肝炎におけるDAA、ペグIFN、リバビリン3剤併用療法とDAA2剤併用療法におけるB細胞HCV RNA及びISG発現動向の比較. (2014)
  • Author(s): 荒井 潤、伊藤敬義、打越 学、下間 祐、宮下みゆき、森川賢一、江口潤一、吉田 仁.
  • Organizer: 第40回日本肝臓学会東部会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都・新宿区）
  • Year and Date: 2014-11-27 – 2014-11-27
• [Presentation] THE HEPATITIS B VIRUS MODULATES CELLULAR FACTORS IN THE DIRECTION OF SLOWDOWN OR STOP CELL CYCLE AND PROLIFERATION. (2014)
  • Author(s): Shimazaki T, Date T, Gouttenoire J, Quadroni M, Moradpour D and Morikawa K.
  • Organizer: The 11th JSH Single Topic Conference.
  • Place of Presentation: ホテルグランビア広島（広島県・広島市）
  • Year and Date: 2014-11-20 – 2014-11-21
• [Presentation] Identification of OCIAD1 as Cellular Substarate of HCV NS3-4A Protease. (2014)
  • Author(s): Tran HT, Morikawa K, Rose Z, Dao Thi VL, Penin F, Heim MH, Donzé O, Quadroni M, Gouttenoire J, Moradpour D.
  • Organizer: 65th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Disease.
  • Place of Presentation: Boston, USA
  • Year and Date: 2014-11-07 – 2014-11-11
• [Presentation] Identification of OCIAD1 as Cellular Substarate of HCV NS3-4A Protease. (2014)
  • Author(s): Tran HT, Morikawa K, Rose Z, Dao Thi VL, Penin F, Heim MH, Donzé O, Quadroni M, Gouttenoire J, Moradpour D.
  • Organizer: 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses.
  • Place of Presentation: Banff, Canada
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [Presentation] 肝細胞癌に対する樹状細胞と抗TIM-3抗体を用いた免疫療法の検討. (2014)
  • Author(s): 林 栄一, 江口潤一, 坂木 理, 土肥弘義, 大森里紗, 梶原 敦, 伊藤敬義, 森川賢一, 吉田 仁, 石井成明, 広石和正, 井廻道夫.
  • Organizer: 第50回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: ホテルニューオータニ（東京都・千代田区））
  • Year and Date: 2014-05-30 – 2014-05-30
• [Presentation] C型慢性肝炎患者に対するTVR3剤併用療法においてB細胞中ISG発現と治療前血清補体値は早期抗ウイルス状態確立に関連する. (2014)
  • Author(s): 荒井 潤、伊藤敬義、打越 学、下間 祐、宮下みゆき、森川賢一、江口潤一、吉田 仁.
  • Organizer: 第50回日本肝臓学会総会.
  • Place of Presentation: ホテルニューオータニ（東京都・千代田区）
  • Year and Date: 2014-05-30 – 2014-05-30
• [Presentation] プロテオミックスによる宿主因子を標的とした肝炎ウイルスによる新規創薬研究の可能性. (2014)
  • Author(s): 森川賢一, 島崎とも江, 吉田 仁.
  • Organizer: 第50回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: ホテルニューオータニ（東京都・千代田区）
  • Year and Date: 2014-05-29 – 2014-05-29
• [Book] 消化器の臨床 (2015)
  • Author(s): 森川 賢一、坂本 直哉
  • Total Pages: ６
  • Publisher: ヴァン メディカル