2015 Fiscal Year Research-status Report
C型肝炎ウイルスの粒子形成・分泌機構の解明と関与する細胞性因子の解析
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26461021
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
森川 賢一 北海道大学, 大学病院, 助教 (60384377)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | C型肝炎ウイルス / ウイルス粒子形成 / ウイルス分泌 / GPｘ８ / NS3-4Aプロテアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的：近年HCV非構造（NS）蛋白3-4Aプロテアーゼが細胞性宿主因子を標的とする事により、HCVの持続感染や病原性に関与していることが示唆されている。我々は、GPx8がHCVのNS3-4Aプロテアーゼにより切断される細胞性因子であり、GPx8はHCVの粒子形成・分泌に必須であると報告した。しかし、どのようにHCV粒子の形成が行われ分泌されていくのか、そこへGPx8がどのように関与しているのか、詳細な分子機構については解明されておらず、HCV粒子形成・分泌阻害をターゲットにした創薬開発も進んでいない。そこで、本研究ではHCV粒子形成・分泌へのGPx8関与のメカニズム解明に取り組むことにより、HCVの粒子形成機構、分泌機構、病原性発現機構を分子レベルで解明し、宿主因子をターゲットにした新たな抗ウイルス薬開発の基盤形成を目指す。
研究計画：平成27年度；A. GPx8および変異体選択的発現調整細胞株、恒常的GPx8ノックダウン細胞株の作成：恒常的GPx8ノックダウン細胞株をレンチウイルスベクターを用いてshRNAにより作成した。；B. 作成した細胞株へのHCV感染実験：作成したGPx8およびその変異体発現調整細胞株を培養液中のテトラサイクリンの有無により、蛋白非発現群と発現群に調整する。恒常的GPx8ノックダウン細胞株とコントロールshRNAを用いた細胞株の比較検討も同様に行った。I)両群に合成した全長HCVウイルス遺伝子RNAを導入し、感染性ウイルス粒子の産生量を比較検討した。II)培養細胞で作成したHCVウイルス粒子（HCVcc）を用いて検討する。培養上清中のウイルス粒子の感染力価および感染細胞内のウイルス粒子の感染力価を比較検討する事によりウイルス粒子の形成・分泌におけるGPx8およびその派生株の役割について検討した。III)免疫蛍光顕微鏡を用いGPx8とHCV蛋白の細胞内局在を詳細に検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度は所属研究機関異動のため若干の遅れが出ていたが、細胞株の作成が順調に行えたことにより計画に沿って実験が行えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画：平成28年度；C. 候補蛋白の抽出：FLAG tag化したGPx8蛋白発現調整細胞株を培養液中のテトラサイクリンの有無により、蛋白非発現群と発現群に調整する。HCVccを感染させた後、抗FLAG tag抗体を用いて免疫沈降によりウイルス粒子形成、および分泌に関与する蛋白を抽出する。；D. 候補蛋白の解析：免疫沈降で得たサンプルをプロテオーム解析を行い同定する。；E. 同定蛋白の機能解析：同定された蛋白を分子生物学的、生物学的種手法を用いて機能解析を行う。①レンチウイルスベクターを用いて標的蛋白強発現細胞を作製し、ウイルス粒子形成および分泌への関与を解析する。②siRNAを使用し、標的蛋白を欠損させウイルス粒子形成および分泌への関与を解析する。③HCVサブジェノミックレプリコンシステムを用いて標的蛋白のHCV複製への影響を解析する。④HCVccを使用することにより、標的蛋白のHCVの生活環への関与を各段階毎に詳細に解析する。
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[Journal Article] A pivotal role of Kruppel-like factor 5 in regulation of cancer stem-like cells in hepatocellular carcinoma.2016
Author(s)
Maehara O, Sato F, Natsuizaka M, Asano A, Kubota Y, Itoh J, Tsunematsu S, Terashita K, Tsukuda Y, Nakai M, Sho T, Suda G, Morikawa K, Ogawa K, Chuma M, Nakagawa K, Ohnishi S, Komatsu Y, Whelan KA, Nakagawa H, Takeda H, Sakamoto N.
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Journal Title
Cancer Biology & Therapy
Volume: 16(10)
Pages: 1453-1461
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Increased expression of immuno-inhibitory molecules on peripheral blood lymphocytes may suppress disease progression in autoimmune hepatitis.2015
Author(s)
Hiraide-Sasagawa A, Hiroishi K, Shimazaki T, Eguchi J, Ishii S, Morikawa K, Sakaki M, Doi H, Omori R, Kajiwara A, Hayashi E, Shiina M, Hirayama Y, Imawari M.
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Journal Title
Hepatology Research
Volume: 45(11)
Pages: 1152-1154
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Intratumoral artery on contrast-enhanced computed tomography imaging: differentiating intrahepatic cholangiocarcinoma from poorly differentiated hepatocellular carcinoma.2015
Author(s)
Tsunematsu S, Chuma M, Kamiyama T, Miyamoto N, Yabusaki S, Hatanaka K, Mitsuhashi T, Kamachi H, Yokoo H, Kakisaka T, Tsuruga Y, Orimo T, Wakayama K, Ito J, Sato F, Terashita K, Nakai M, Tsukuda Y, Sho T, Suda G, Morikawa K, Natsuizaka M, Nakanishi M, Ogawa K, Taketomi A, Matsuno Y, Sakamoto N.
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Journal Title
Abdominal Imaging
Volume: 40(6)
Pages: 1492-1499
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Analysis of cellular factors involved in the particle formation and secretion of hepatitis C virus.2016
Author(s)
Morikawa K, Izumi T, Umemura M, Ito J, Tsunematsu S, Sato F, Nakai M, Sho T, Suda G, Ogawa K, Sakamoto N.
Organizer
The 25th Asian Pacific Association for the Study of the Liver (APASL 2016).
Place of Presentation
国際会議場パミール（東京都・港区）
Year and Date
2016-02-22 – 2016-02-22
Int'l Joint Research
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[Presentation] C型肝炎ウイルスの粒子形成・分泌機構の解明と関与する細胞性因子の解析.2015
Author(s)
森川賢一, 島崎とも江, 伊藤 淳, 常松聖司, 佐藤史幸, 寺下勝巳, 佃 曜子, 中井正人, 荘 拓也, 須田剛生, 夏井坂光輝, 小川浩司, 坂本直哉.
Organizer
第51回日本肝臓学会総会
Place of Presentation
ホテル日航熊本（熊本県熊本市）
Year and Date
2015-05-21 – 2015-05-21
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