2014 Fiscal Year Research-status Report
葉酸レセプターβ抗体を用いた分子イメージングの前臨床試験と新規診断法の開発
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26461148
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
宮田 昌明 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (00347113)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大石 充 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (50335345)
桶谷 直也 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 講師 (70598010)
小澤 政之 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90136854)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 葉酸レセプターβ / 活性化マクロファージ / 動脈硬化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
活性化マクロファージ（Mφ）に特異的に発現する葉酸レセプターβ（FRβ）に対するモノクローナル抗体を用い３つの研究を行う。①抗FRβモノクローナル抗体を用いた蛍光分子イメージングにより動脈硬化モデルマウスに対する薬物治療による動脈硬化抑制効果を感知できるか前臨床試験を行う。②抗FRβモノクローナル抗体にマイクロバブルを結合させた造影剤により、活性化マクロファージが存在する不安定プラークを認識する超音波による分子イメージングを大型動脈硬化モデル動物であるアポ蛋白(a)過剰発現クラウンミニブタを用いて前臨床試験を行う。③血中の可溶性FRβ濃度をELISA法により測定し、動脈硬化や心房細動患者の治療による変化を検討し、予後予測因子となるかを検討する。
①抗FRβモノクローナル抗体を用いた蛍光分子イメージング：マウスFRβを遺伝子導入したマウスB300-19細胞をヌードマウスに免疫し、マウス抗FRβ抗体を蛋白精製し、抗FRβモノクローナル抗体を作成した。この抗FRβモノクローナル抗体をAlexa Fluor 488で標識し、一匹あたり100マイクログラムをアポ蛋白E欠損マウスの尾静脈から注射投与、２時間後マウスを屠殺して大動脈全体を摘出し、MaestroTM in-vivo imaging systemにて488nmで励起し、520nmで撮影し蛍光発色を画像解析する分子イメージングを行った。
②抗FRβモノクローナル抗体を用いた超音波分子イメージング：アポ蛋白(a)過剰発現クラウンミニブタの動脈硬化病変を解析中である。
③ELISA法による可溶性FRβ血中濃度測定の臨床的意義の検討：ヒトFRβ発現B300-19(マウスB細胞株）をラットに免疫した腹腔内リンパ節を用い、細胞融合法にて抗FRβ抗体を作成し、サンドイッチELISA測定法を用い、ヒト血清の可溶性FRβを測定する方法を作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①FRβモノクローナル抗体を用いた蛍光分子イメージング：FRβモノクローナル抗体を用いた蛍光分子イメージングを用い、最終的にはテルミサルタンあるいはフルバスタチン投与による動脈硬化抑制効果をこの蛍光分子イメージング定量解析で評価できるか検討することにある。現在、テルミサルタンを動脈硬化のモデルマウスである2週齢の普通餌飼育のアポ蛋白E欠損マウスに投与する実験を開始しており、概ね順調に実験計画どおりに進捗している。
②FRβモノクローナル抗体を用いた超音波分子イメージング：抗FRβモノクローナル抗体を用いFRβを認識するマイクロバブル（MB）による分子イメージングを我々が開発した大型の動脈硬化モデルであるapo(a)過剰発現トランスジェニッククラウンミニブタで行う予定であり、現在、apo(a)過剰発現トランスジェニッククラウンミニブタの動脈硬化病変の病理学的解析を進めるとともに研究に使用するapo(a)過剰発現トランスジェニッククラウンミニブタを繁殖中であり、概ね計画通りに進行している。
③ELISA法による可溶性FRβ血中濃度測定の臨床的意義の検討：我々が開発したELISA法で血中可溶性FRβ濃度を測定し、動脈硬化疾患患者のスタチンやARBの治療前と治療後6ヶ月、一年後に測定し、どのように変化するか検討し、治療効果や予後判定に用いることができるか検討する予定である。現在、動脈硬化患者の血清をストックしており、概ね計画通りに進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
①FRβモノクローナル抗体を用いた蛍光分子イメージング：12週齢の普通餌飼育のアポ蛋白E欠損マウスをテルミサルタン群10匹とコントロール群10匹に分け、10週間後の22週齢で蛍光分子イメージングと動脈硬化組織像の検討を行い、両群を比較する。蛍光分子イメージングは、抗FRβモノクローナル抗体をAlexa Fluor 488で標識し、一匹あたり100マイクログラムをアポ蛋白E欠損マウスの尾静脈から注射投与し、２時間後、マウスを屠殺し大動脈全体を摘出し、MaestroTM in-vivo imaging systemにて488nmで励起し、520nmで撮影して行う。
②FRβモノクローナル抗体を用いた超音波分子イメージング： distearoylphosphatidylethanolamine-PEG(2000)biotinとdistearoylphosphatidylcholineとpolyoxy-ethylene-40-stearateとを超音波処理してビオチン化されたマイクロバブル（MB）を作成する。MBとstreptavidinを30分間インキュベーションし、結合させる。その一部を取り出し、EZ-Link（Pierce社）を用いビオチン化した抗マウスIgG1抗体と抗FRβモノクローナル抗体を30分間結合させて、FRβを認識するMBを作成する。このFRβを認識するMBをapo(a)過剰発現トランスジェニックミニブタに静脈注射して、超音波検査装置を用いて頸動脈や腹部大動脈画像解析する。コントロールとしては、抗FRβモノクローナル抗体の代わりに非特異的一次抗体を結合させたものを用い画像を比較する。
③ELISA法による可溶性FRβ血中濃度測定の臨床的意義の検討：動脈硬化疾患患者のストック血清を用いELISA法による可溶性FRβ血中濃度を測定する。
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