2014 Fiscal Year Research-status Report
悪性中皮腫における薬剤耐性の克服と分子標的治療の開発
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26461183
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Research Institution | Chiba Cancer Center (Research Institute) |
Principal Investigator |
関根 郁夫 千葉県がんセンター(研究所), 呼吸器内科, 部長 (10508310)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩澤 俊一郎 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (00527913)
瀧口 裕一 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30272321)
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Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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Keywords | 悪性中皮腫 / 薬剤耐性 / 化学療法 / ペメトレキセド / 遺伝子発現 |
Outline of Annual Research Achievements |
悪性中皮腫は一般に抗がん剤耐性であることが多く、第一選択薬であるシスプラチンとペメトレキセドの併用によっても、平均生存期間が12ヶ月余りである。しかも、比較的短い治療時間で耐性が誘導され、効果が期待できない症例が多い。さらに、第二選択薬が知られていないため、当該抗がん剤耐の性克服は悪性中皮腫の予後の改善にとって極めて重要な課題の一つである。そこで、本研究ではペメトレキセド耐性の機序を解明し、その耐性克服の糸口を見出し、より効果的な抗がん剤治療の開発を目的とした。そこで、まず4種類にヒト悪性中皮腫細胞について、ペメトレキセド耐性株を、コロニー形成能を指標に確立した。チミジンキナーゼの発現亢進がペメトレキセド耐性に関与することが知られているので、当該遺伝子を除いて、2種類の耐性株と親株(NCI-H28、NCI-H228)のペアーに関して網羅的に遺伝子発現を検討(Agilent社Whole human Gemome Arrayを使用)したところ、6遺伝子(ANKRD1、ADRB2、SERPINE1、ITGB3、ADAMTS5、IGFBP3)が、2種類の耐性株で共に上昇していた。そこで、当該薬剤耐性の確認するため、別なアッセイ法であるWST試薬を用いて、ペメトレキセドに対する細胞障害活性を検討すると、確かに耐性株は細胞障害活性が低下していた。さらに他の2種類の細胞(MSTO-211H, NCI-H2454)についても同様に検討し、ペメトレキセド耐性を確認した。次に、mRNAレベルの発現上昇が、実際に蛋白質レベルでも発現の上昇が見られるかを確認するために、当該蛋白質に対する抗体を用いてウエスタンブロット法で検討すると、ANKRD1とIGFBP3分子が、NCI-H28、NCI-H228細胞をはじめMSTO-211H, NCI-H2454細胞でも発現上昇が見られた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初選択した候補6遺伝子の発現上昇はすべてmRNAであるため、薬剤耐性の関与をさらに検討するために、ウエスタンブロット法で蛋白質上昇を確認する必要があった。そこでまず、当初のNCI-H28、NCI-H228細胞で、各分子についてスクリーニングを検討すると、ANKRD1とIGFBP3の2分子のみが、親株に比較して、ペメトレキセド耐性株で上昇していた。さらに、この2分子の発現は、別なペアーであるMSTO-211H, NCI-H2454細胞でも耐性株で上昇していたことから、ペメトレキセド耐性に関する有力は候補分子と判断できた。また、コロニー形成能のみならず、WST法においても、上記4種類の耐性株はペメトレキセドに対するIC50が最大で約100倍上昇していることを確認した。
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Strategy for Future Research Activity |
これまでの解析で、2種類の分子がペメトレキセド耐性に関することを確認しえたので、複数の遺伝子配列を標的としたsiRNAを使用して、当該分子の蛋白質発現を抑制する。このとき、siRNAの導入効率を検討し、もし効率が不良であれば、導入効率に関する試薬を変更して最適条件を検索する。さらに蛋白質発現を低下させた薬剤耐性株を使用して、WST法による細胞障害活性が回復することを実証する。また、当該分子のcDNAを発現ベクターに組み込み、親株に同分子を発現させて、WST法を用いて細胞障害活性が低下するかどうかを検討する。
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Causes of Carryover |
2014年7月に主任研究者が施設を変更し、研究開始が遅くなったため
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Expenditure Plan for Carryover Budget |
耐性株のWST法による確認実験、ウエスタンブトット法による検討が順調に進行したため、研究費用の多少の余裕が生じ、一部のsiRNAの購入等にも使用できた。本年度以降においては、各種siRNAを複数の薬剤耐性株(対照として親株にも)に導入するため、当該siRNA、siRNA導入試薬、またsiRNA導入効率を検討する試薬、候補遺伝子の発現ベクター作成等に関する分子生物試薬、細胞培養系を用いた細胞死の検討のため細胞培養関係の物品、その他抗体等の一般生化学試薬、さらに動物実験用のマウス等の購入に使用する。
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