2014 Fiscal Year Research-status Report
網羅的miRNA解析による非小細胞肺癌浸潤転移規定因子同定と治療への応用
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26461195
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
小山 信之 自治医科大学, 医学部, 准教授 (30353460)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | EZH2発現 / マイクロRNA発現 / EMT / 非小細胞肺癌 / 小細胞肺癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肺癌細胞株におけるenhancer of zeste homolog 2 (EZH2) mRNAの発現をリアルタイムPCRにて確認するため、非小細胞肺癌細胞株の種類をこれまでよりも増やすとともに小細胞肺癌細胞株も数種類増やして解析を行った。これら肺癌細胞株におけるEZH2 mRNA発現を確認したところ、多くの非小細胞肺癌細胞株においてもEZH2 mRNA発現の亢進がみられたが、小細胞肺癌細胞株、特にSBC1とSBC5の2種類の細胞株において最も高い発現がみられた。そのため非小細胞肺癌とともに小細胞肺癌における上皮間葉転換（EMT）との関連を評価することとして、既に当病院内倫理審査会にて承認済みだった免疫組織化学を用いた非小細胞肺癌および小細胞肺癌切除検体におけるEZH2とEMTのマーカーであるE-カドヘリン蛋白発現解析を行った。その結果、非小細胞肺癌細胞株においてEZH2発現の亢進とE-カドヘリン発現の低下がみられ、EZH2発現とEMTが正に相関していることを確認したが、小細胞肺癌ではさらにEZH2発現亢進とE-カドヘリン発現低下が著しいことを発見した。
以上から肺癌では概ねEZH2発現とEMTの誘導が亢進し、肺癌においてEZH2がEMTに直接関連している可能性が示唆された。特に小細胞肺癌細胞株においてその傾向が強いことが示される一方、非小細胞肺癌細胞株においてもH1975、H1650（各腺癌細胞株）やSQ5（扁平上皮癌細胞株）などがEZH2 mRNA発現が有意に亢進していた。今回の結果から、今後非小細胞肺癌に加えて小細胞肺癌についても研究を進めることとした。学内および院内における研究体制の調整も終了したため、現在臨床検体集積を開始している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では初年度に臨床検体（径の異なる原発巣、原発巣とリンパ節転移巣）を用いたマイクロRNA網羅的解析を行うこととし、自治医科大学遺伝子解析倫理委員会からの承認を得た。しかし当院研究室が平成26年に新築・移転したことと、学内および院内における研究体制の最終調整を必要としたために臨床検体採取とマイクロRNA抽出をただちに行うことが難しくなった。そのため既に切除され当院に保存されている臨床検体と細胞株を用いた研究を先行させることとした。その結果、肺癌細胞株に対するリアルタイムPCRを用いたEZH2 mRNA発現解析において、予想した通り多くの非小細胞肺癌株でEZH2 mRNAの発現が亢進していたが、小細胞肺癌においては予期していた以上に著しい高発現がみられた。このことからEZH2とEMTの関係を解明するには、非小細胞肺癌のみならず小細胞肺癌に対しても解析を行うのが本研究の進展に必要と考え、当初の計画に小細胞肺癌を追加して研究を進めることとした。
初年度の計画に組み入れていた臨床検体を用いた解析は、平成27年度研究として現在進行中であり検体を集積している。これらの検体を用いてEZH2発現解析からマイクロRNA網羅解析へと研究を進めていく予定であり、そのためにすでに細胞株からのマイクロRNA抽出を開始している。EZH2とEMTとの関連を評価するために行っている細胞株を用いたEZH2とEMTマーカーの発現解析については、EZH2と最も重要なEMTマーカーといえるE-カドヘリンの発現を確認している。転写因子については現在解析中であるが、概ねE-カドヘリン発現と相関している。
以上から当初の計画と実際の実験内容が若干前後したところはあったが、全体としては予定通り順調に研究が進行しているものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当院研究室の新築・移転は完了して既に研究を行っている状況であり、学内および当院内における研究体制の調整も終了したため現在は研究の遂行に支障はなく、当初の計画だった臨床検体採取を開始している。今後は計画通りEZH2発現解析により本研究に合致した臨床検体を同定し、マイクロRNAの抽出および網羅的解析を行う予定となっている。また臨床検体を用いた研究の遂行に万全を期し、さらに研究を迅速に推進させる方策として、学外施設との連携・研究協力も視野に入れ、すでに協力体制も構築している。一方で臨床検体を用いた研究以外に細胞株についてもマイクロRNA網羅的解析を行うこととした。このことにより本研究から得られる結果を補完することが可能となるものと推測される。実際にはこれまで予定していた非小細胞肺癌細胞株のみならずEZH2高発現とE-カドヘリン低発現（EMT誘導）を示す小細胞肺癌細胞株に対してshRNAを用いたEZH2遺伝子発現ノックダウンを行う。EZH2発現の低下によるマイクロRNA発現の変化を網羅的解析により確認し、非小細胞肺癌、小細胞肺癌いずれにおいても特に発現の変化がみられたマイクロRNAを抽出する。臨床検体を用いた解析から抽出したマイクロRNAともあわせて、EZH2と関連する新たなマイクロRNAを同定する。これらの解析により同定したマイクロRNAに対する細胞株を用いた研究の遂行がより円滑になることが期待される。また新たなマイクロRNAの機能解析についても、初年度に細胞株を用いた研究を先行させていたことで既に研究体制は整っており、支障なく遂行できる。
以上から本研究推進のため、当初の実験計画に加えて新たな実験・解析を予定しており、現在その進捗も順調なため、研究は予定通り遂行できるものと思われる。
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