間質性肺炎におけるﾏｲｸﾛRNA、エクソソームを介する病態の解析と臨床応用

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461204
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 功刀 しのぶ 日本医科大学, 医学部, 講師 (30350036)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺崎 泰弘 日本医科大学, 医学部, 准教授 (50332870)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: microRNA / エクソソーム / 間質性肺炎 / 気管支肺胞洗浄液

Outline of Annual Research Achievements

①ブレオマイシン肺炎モデルを作成し、コントロール肺と投与後２１日の線維化期において、肺組織、肝臓、腎臓、脾臓組織の採取と血清、気管支肺胞洗浄液採取を行った。肺組織からは、凍結組織の採取他、パラフィン固定標本、電顕検体、4%PFA固定凍結標本の作成を行った。
②ＨＥ染色にて投与後２１日には、リンパ球、好中球などの炎症細胞とともに腔内の線維化とそれを被覆する腫大したII型肺胞上皮と腔内には組織球浸潤も目立っていた。
③気管支肺胞洗浄液は超遠沈を行い、エクソソーム分画とそれ以外の分画を行った。エクソソームは、電顕にて形態的な同定を行った。エクソソーム分画については、固定、LR whiteによる包埋を行い、エクソソームマーカーCD63,組織球マーカーMac2,II型肺胞上皮マーカーSP-C抗体を用いた免疫電顕を行い、由来の同定を行った。
④気管支肺胞洗浄液のエクソソーム分画とそれ以外の分画からそれぞれmiRNAの抽出を行った。
微量なため５匹を１つの検体として、コントロールと線維化期からmiRNA抽出を行い、miRNA Ready-to-Use PCR,Mouse&Rat panel I+II(Exiqon)を用いてReal time-PCRに基づくmiRNAの網羅的解析を行った。気管支肺胞洗浄液中のmiRNAは、エクソソーム分画より、それ以外に多く含まれていた。網羅的解析により、分画によって違うmiRNAが上昇や低下がしていることがわかった。
⑤組織、血清からもmiRNA抽出を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

①気管支肺胞洗浄液中のエクソソーム由来のmiRNAは微量なため、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて、品質検定を行った。
②気管支肺胞洗浄液中のエクソソームの由来細胞の同定を行うために免疫電顕を行ったが、エクソソームの固定条件、電顕包埋剤などの条件設定に時間がかかった。

Strategy for Future Research Activity

①組織、血清からmiRNAを抽出し、気管支肺胞洗浄液と同様にmiRNAの網羅的解析を行っており、気管支肺胞洗浄液中のエクソソーム分画とそれ以外、肺組織、血清を比較し、線維化に関わるmiRNAの同定を行う。
②同定されたmiRNAについて、ブレオマイシン肺炎(投与後3,7,14,21日）の経時的変化の確認を行う。
③同定されたmiRNAの組織の局在をみるため、in situ hybridizationを行う

Causes of Carryover

気管支肺胞洗浄液からのエクソソーム分画とそれ以外の分画からのmiRNAが微量で品質検定に手間取ったため、網羅的解析を行う予定であった気管支肺胞洗浄液からの２つの分画、肺組織、血清からmiRNAの検体を準備するのに時間がかかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

現在では、検体の採取、miRNAの準備ができ、コントロール肺組織、血清、気管支肺胞洗浄液のエクソソーム分画とそれ以外のmiRNAと線維化期のそれぞれのmiRNAの網羅的解析が進行中で、比較解析費用に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Effective Crizotinib schedule for an elderly patient with ALK rearranged non-small-cell lung cancer: a case report. (2015)
  • Author(s): Fukuizumi A, Miyanaga A, Seike M, Kato Y, Nakamichi S, Chubachi K, Matsumoto M, Noro R, Minegishi Y, Kunugi S, Kubota K, Gemma A
  • Journal Title: BMC Res Notes. Volume: 8 Pages: 165
  • DOI: 10.1186/s13104-015-1126-8.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Epicardial Catheter Ablation of Ventricular Tachycardia in No Entry Left Ventricle: Mechanical Aortic and Mitral Valves (2015)
  • Author(s): Soejima K, Nogami A, Sekiguchi Y, Harada T, Satomi K, Hirose T, Ueda A, Miwa Y, Sato T, Nishio S, Shirai Y1, Kowase S, Murakoshi N, Kunugi S, Murata H, Nitta T, Aonuma K, Yoshino H
  • Journal Title: Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology Volume: 8 Pages: 381-389
  • DOI: 10.1161/CIRCEP.114.002517.
  • Peer Reviewed