Clinical usefulness of anti-M-type phospholipase-A-receptor antibodies in patients with membranous nephropathy and the comparison of three quantification methods

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26461242
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 勝又 康弘 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (60349719)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 膜性腎症

Outline of Annual Research Achievements

本研究計画では、膜型ホスホリパーゼA2受容体に対する血清抗体（抗PLA2R抗体）の測定法として、汎用性、簡便性、定量性に優れた、ELISAを開発すること、開発したELISAおよび従来法を用いて、日本人の成人の特発性膜性腎症における血清抗PLA2R抗体の特徴の解析をすることを目的とした。
本年度（平成29年度）は、PLA2Rの安定形質発現株を抗原としたウェスタンブロットとCell ELISA、および研究開始後に海外で発売された市販ELISAキットを用いて、日本人特発性膜性腎症においても、約50%の陽性率があることを報告した論文を投稿し、査読中である。
また、ポドサイトのセルラインを用いて、抗PLA2R抗体の病原性についても検討する方針とした。安定した実験系を構築するためには、安定形質発現の構築が望ましいため、ポドサイトのセルラインにPLA2Rを恒常的に強発現させて病態研究をする方針とし、作製した（当初の予定期間内に完成しなかったので、補助事業期間延長の上、行われた）。
具体的には、安定形質発現株作製の第1段階として、まず、フルレングスのヒトPLA2R 遺伝子情報を合成した遺伝子をベクターに挿入し、次に、発現ベクターをヒトポドサイト細胞株にトランスフェクションし、目的遺伝子の発現をRT-PCRで確認した。トランスフェクション後の細胞を抗生剤を含む培地中で、約3か月間継代培養した。
樹立した安定発現細胞および宿主細胞からtotal RNAを抽出し、cDNAを合成した。PCRを行い、アガロースゲル電気泳動により増幅産物を確認した。また、フローサイトメトリー解析にて、目的蛋白（=ヒトPLA2R）の発現を確認した。