2014 Fiscal Year Research-status Report
マイオスタチン阻害ペプチドによる筋ジストロフィーとサルコペニア治療法の開発
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26461285
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
大澤 裕 川崎医科大学, 医学部, 講師 (80246511)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西松 伸一郎 川崎医科大学, 医学部, 講師 (20222185)
村上 龍文 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (30330591)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 筋萎縮 / 筋ジストロフィー / サルコペニア / マイオスタチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
筋ジストロフィーは筋細胞の変性・壊死から筋萎縮を来す遺伝性疾患群で、有効な治療法は皆無である。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)ではTGF-βシグナル分子LTBP4によって運動予後が規定される。一方、加齢性筋萎縮（サルコペニア）は骨格筋幹細胞のTGF-β活性上昇により筋再生が障害される。マイオスタチンは骨格筋に特異的に発現し筋量を負に制御するユニークなTGF-β分子である。われわれは、独自アッセイ系により、マイオスタチンリガンドを流血中で生理的に阻害するプロドメインから、その阻害活性中心を絞り込んだ。本研究は、この阻害活性中心ペプチドを、DMDおよびサルコペニアモデルへ投与しTGF-β是正筋萎縮治療の可否と機構解明を目指す。平成26年度は、ペプチドの用量を振って、野生型マウスへ投与し筋肥大効果と骨格筋マイオスタチン活性を検討し投与条件を設定した。この過程で、プロドメインが、筋細胞表面で、リガンド-受容体結合を阻害するという、新たな薬理機構を発見した。この成果から、このペプチド医薬のPCT出願（PCT/JP2014/52345）に成功し、併せて論文発表ができた (Takayama,Ohsawa, et al. J Med Chem 58;1544-1549,2015)。モデルマウスへのペプチド投与に取り組み、その筋萎縮治療効果とモデルマウス骨格筋のTGF-βシグナル是正機構の解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マイオスタチン阻害ペプチドについて用量を振って、野生型マウスの投与し、ペプチド投与条件を設定した。条件設定したペプチドを、最重症型DMDモデルマウス及びサルコペニアモデルマウスに投与を開始し、筋萎縮・筋力低下の改善効果の検討している。本年度、DMDモデルDBA/2-mdxマウスは、大阪大学から実験医学中央研究所へ寄託されクリーンアップを実施した。このため、このマウスの繁殖に時間が掛かっている。そこで、一期的投与でなく、複数回に分けてペプチド投与を開始して研究を進捗させている。経時的に生理学的解析（体重・握力・走力・血中CK値）を実施している。血中及び骨格筋マイオスタチン/TGF-βシグナルシグナルの変動(転写因子活性化p-Smad2/3蛋白質量、標的遺伝子p21, p16発現量）、骨格筋幹（衛星）細胞動態、及びKaplan-Meier法により寿命解析をおこない、ペプチド投与群で筋萎縮が改善して、TGF-βシグナルが是正されるか検討している。また副作用モニターのため血液生化学検査を並行している。骨格筋摘出後には直ちに電気刺激によって張力（相対力・絶対力）を測定し投与群で筋力低下が改善するか検討を予定する。摘出筋を組織学的に解析して、投与群で、筋線維（単一筋線維断面積）萎縮、ジストロフィー性変化（壊死線維数・再生線維数・線維化指数・脂肪化指数）の軽減が達成されるか、そのマイオスタチン活性との相関について解析を進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度以降には、モデルマウスへのペプチド投与を継続するとともに、マイオスタチンシグナル下流で働く新たな骨格筋萎縮及び肥大遺伝子の同定に取り組む。まず骨格筋遺伝子発現プロファイリングによって、マイスタチン阻害ペプチド投与群と非投与群の発現に差異のある分子を登録する。次いで、候補遺伝子群をわれわれが既に習熟しているレトロウイルスベクターpMXs-IRES-GFP (Ohsawa Y, et al. Lab Inv, 92:1100-1114, 2012) にサブクローニングする。次いでパッケージング細胞へトランスフェクションしてウイルス抽出しC2C12マウス筋芽細胞に感染させ遺伝子を発現させる。この筋芽細胞の低濃度ウマ血清培地による筋管分化誘導アッセイを行う。筋管分化効率を比較し、マイオスタチンシグナル下流で働く骨格筋萎縮及び肥大遺伝子を絞り込む。さらにレンチウイルスベクターへ組み込んで、マウス骨格筋への局所投与し、新規筋萎縮及び肥大遺伝子を同定する。マイオスタチンを起点とするこれらの新規遺伝子を標的とした治療開発へ繋げたい。次年度研究費は、主として、マウス骨格筋解析と、骨格筋萎縮及び肥大遺伝子の同定のためのPCRなどの分子生物試薬、及び細胞培養を計上した。
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| Causes of Carryover |
H26年度に発注した修理及び消耗品の支払いが、H27年度となったため次年度使用額が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額分については上記の通り、修理費・消耗品費として執行する。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Identification of the minimum peptide from mouse myostatin prodomain for human myostatin inhibition.2015
Author(s)
Takayama K, Noguchi Y, Aoki S, Takayama S, Yoshida M, Asari T, Yakushiji F, Nishimatsu S, Ohsawa Y, Itoh F, Negishi Y, Sunada Y, Hayashi Y.
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Journal Title
J Med Chem
Volume: 58
Pages: 1544-1549
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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