2014 Fiscal Year Research-status Report
脳小血管病に関わる抗血管内皮抗体の同定と機能解析：病態解明とバイオマーカーの開発
| Project/Area Number |
26461290
|
|---|
| Research Institution | Gifu University |
|---|
Principal Investigator |
木村 暁夫 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00362161)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢野 竹男 三重大学, 地域イノベーション学研究科, 教授 (00569197)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 神経病態免疫学 / 自己抗体 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
脳小血管病の病態機序の解明とバイオマーカーの確立を目的として、大脳微小血管内皮細胞を標的とする抗血管内皮抗体に着目し研究を行った。これまでに当科もの忘れ外来受診患者153名に対し、臨床診断および画像検査・採血検査を施行した。採取した血清を用いたヒト大脳微小血管内皮細胞に対する免疫染色を行い、抗血管内皮抗体のスクリーニングを行った。この内、高度の脳小血管病態を伴うアルツハイマー型認知症患者の血清中より、抗血管内皮抗体を検出した。次にこの患者の血清を用いlive cellの状態で大脳微小血管内皮細胞と免疫沈降を行い、SDS-PAGEにて展開したゲル上のバンドを切り抜き、LC-TOF/MSを用いて抗血管内皮抗体の認識抗原蛋白の同定を試みた。結果、1つのバンドよりHexokinase-1（HK1）を同定した。Hexokinaseは、解糖系酵素の１つであり、グルコースと結合しグルコース6リン酸を生産している。あらゆる細胞のミトコンドリア外膜に発現しているが、type 1は脳内に多く存在し、brain form hexokinaseとも呼ばれている。今回の検討では、HK1は大脳微小血管内皮細胞膜表面に発現している可能性も示唆され、HK1と反応した抗体が細胞内へのグルコースの取り込みを阻害することにより血管内皮細胞のエネルギー産生の阻害を介しBBBの破綻に関連している可能性が推測された。現在、抗HK1抗体のさらなる特異性の検討と機能解析を施行中である。
一方、健常者の血清中に認められる抗血管内皮抗体に関する知見が不可欠と考え、二次元免疫ブロット法により30名の健常者の血清を用いて抗血管内皮抗体の同定を行った。この内の25％以上の血清中に存在する抗血管内皮抗体の認識抗原として、78-kDa glucose-regulated proteinをはじめとする合計7個の抗原蛋白を同定し報告した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、抗血管内皮抗体のスクリーニング法としてSolubilized cell surface protein-capture ELISA法を用いる予定であったが、システムの確立が難しく、現在ヒト大脳微小血管内皮細胞を用いた免疫染色によりスクリーニングを行っている。そのため、目標とする200名でのスクリーニングが終了していないのが現状である。しかし、その一方で、数名の血清中において大脳微小血管内皮細胞膜表面に反応する抗血管内皮抗体を検出することができ、その内の1名の患者血清中に存在する抗血管内皮抗体の認識抗原蛋白がHexokinase-1であることを同定することができた。さらに30名の健常者の血清中に多く存在する7個のcommonな抗血管抗体を同定することができたことは、今後の研究の発展につながると考えおおむね順調に進展していると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後も、引き続きヒト大脳微小血管内皮細胞を用いた免疫染色により、当科ものわすれ外来受診患者の血清中に存在する細胞膜表面抗原を認識する抗血管内皮抗体のスクリーニングを行う。さらにスクリーニング陽性者の血清中より、免疫沈降法とLC-TOF/MSを用いる方法により、新たな抗血管内皮抗体の同定を継続して行っていく予定である。さらに、今回同定した抗HK1抗体を含めて、あらたに同定した抗血管内皮抗体の特異性を検討するために、ELISA法などによる多数例での検討と、抗体の機能解析を行い、脳小血管病の病態機序の解明とバイオマーカーの確立を目指す。
|
