セマフォリン3Gによる膵α細胞の恒常性維持機構解明と糖尿病治療への応用

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461326
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 河村 治清 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70527902)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 一貴 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座教員 (30400998) ; 竹本 稔 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60447307) ; 徳山 宏丈 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (90385039)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: セマフォリン3G / グルカゴン / 膵α細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、新規のセマフォリン分子であるセマフォリン3G (Sema3G) がグルカゴン分泌を調節し、糖代謝の恒常性維持に寄与しているという仮説のもと、研究をすすめている。
ノックアウトコンストラクトにLacZ遺伝子を導入したsema3g LacZ/+マウスを用いた基礎検討で、腎糸球体のみならず、膵臓においてもSema3Gが発現していることが確認されていたが、膵臓における発現細胞を明らかにするため、さらに、βガラクトシダーゼと膵島構成細胞の特異的マーカーに対する二重染色を行った。その結果、βガラクトシダーゼとインスリンとの共染色を認め、Sema3Gは膵β細胞に発現していることが示唆された。また、膵島外ではPECAMとの共染色がみられ、血管内皮細胞にも発現しているものと考えられた。一方で、Sema3Gの受容体として報告されているニューロピリン2はグルカゴンと共発現しており、膵α細胞で発現していることが免疫染色で明らかになった。このことより、膵β細胞で分泌されたSema3Gが膵α細胞にパラクラインに作用しうることが示唆された。
さらに、Sema3Gの糖代謝における影響を明らかにするため、Sema3Gノックアウトマウスの解析をすすめた。空腹時の血中グルコースおよび、インスリン濃度は野生型マウスと同程度であり、腹腔内ブドウ糖負荷試験でも血中グルコース濃度の反応性に有意な差はみられなかった。一方で、空腹時の血中グルカゴン濃度はsema3gノックアウトマウスにおいて有意に低値であり、Sema3Gが膵α細胞に作用し、グルカゴン分泌に影響を及ぼしていることが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成26年度はグルカゴン分泌制御におけるSema3Gの関与を明らかにするため、Sema3Gノックアウトマウスの糖代謝および形態学的解析を行い、さらに培養膵α細胞を用いたin vitroの解析を行うことを立案していた。現在は、ノックアウトマウスの糖代謝の解析を行っている段階であり、当初の計画より、やや遅れている。理由としては、マウスの繁殖効率が低下した時期があり、実験に必要なマウスの数を得るのに時間を要したことがあげられるが、この問題は現在解消されている。Sema3Gノックアウトマウスの膵臓の形態学的評価もすすめているところであり、結果は揃いつつある。また、添加実験に用いるSema3Gリコンビナント蛋白の精製を行い、in vitroの検討も開始する準備は順調に整いつつあり、ノックアウトマウスの結果をうけて、解析をすすめていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

今年度の結果を受け、平成27年度以降は、Sema3Gが膵α細胞機能にどのように影響を及ぼすのかを解明する。まず、Sema3Gノックアウトマウスにおける、膵島の数・大きさ、膵α細胞・膵β細胞を始めとする構成細胞の割合などの膵島の形態変化を、免疫染色および電子顕微鏡による観察で詳細に検討する。また、膵α細胞のグルカゴン分泌は膵島を取り巻く微小循環や自律神経による調節も受けているが、セマフォリンは元来、神経の走行を規定する因子として同定され、さらに、血管新生への関与も知られていることから、膵島周囲の神経および、血管網の構造に関しても免疫染色および電子顕微鏡で解析する。また、gain-of-functionの系としてアデノウイルスベクターによりSema3Gを過剰発現したマウスにおける、糖代謝、膵臓の形態変化も検討する。
in vitroでは、培養膵α細胞にSema3Gリコンビナント蛋白を添加し、グルコース、インスリン、脂肪酸などの刺激に対するグルカゴン分泌応答変化をELISA法にて解析する。また、増殖、アポトーシスへの影響をBrdUおよびTUNEL染色にて検討する。さらに、関与する受容体および、その細胞内シグナルに関しても検討を行っていく。
また、糖尿病の病態進展へのSema3Gの関わりを明らかにするため、1型および、2型糖尿病モデルマウスの膵島におけるSema3Gの発現変化をリアルタイムPCRで確認し、加えて、その発現調節機構を培養細胞を用いたin vitroの検討で解析していく。
以上の検討により、Sema3Gの糖尿病の病態生理への関与を明らかにし、新たな治療戦略となる可能性を明らかにしていきたい。

Research Products

• [Journal Article] Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide protects glomerular podocytes from inflammatory injuries. (2015)
  • Author(s): Sakamoto K, Kuno K, Takemoto M, He P, Ishikawa T, Onishi S, Ishibashi R, Okabe E, Shoji M, Hattori A, Yamaga M, Kobayashi K, Kawamura H, Tokuyama H, Maezawa Y, Yokote K
  • Journal Title: J Diabetes Res Volume: - Pages: 印刷中
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1155/2015/727152
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Enhanced vascular endothelial growth factor signaling in islets contributes to β cell injury and consequential diabetes in spontaneously diabetic Torii rats. (2014)
  • Author(s): Mukai E, Ohta T, Kawamura H, Lee EY, Morita A, Sasase T, Miyajima K, Inagaki N, Iwanaga T, Miki T
  • Journal Title: Diabetes Res Clin Pract Volume: 106(2) Pages: 303-311
  • DOI: doi: 10.1016/j.diabres
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficacy and safety of the dipeptidyl peptidase-4 inhibitor sitagliptin compared with α-glucosidase inhibitor in Japanese patients with type 2 diabetes inadequately controlled on sulfonylurea alone (SUCCESS-2): a multicenter, randomized, open-label, non-inferiority trial. (2014)
  • Author(s): Kobayashi K, Yokoh H, Sato Y, Takemoto M, Uchida D, Kanatsuka A, Kuribayashi N, Terano T, Hashimoto N, Sakurai K, Hanaoka H, Ishikawa K, Onishi S, Yokote K; SUCCESS Study Group
  • Journal Title: Diabetes Obes Metab Volume: 16(8) Pages: 761-765
  • DOI: DOI: 10.1111/dom.12264
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 粥状動脈硬化形成におけるSemaphorin 3Gの機能解析 (2014)
  • Author(s): 山賀 政弥、河村 治清、竹本 稔、小林 一貴、徳山 宏丈、前澤 善朗、石川 崇広、大西 俊一郎、石橋 亮一、賀 鵬、北本 匠、坂本 憲一、服部 暁子、正司 真弓、横手 幸太郎
  • Organizer: 第29回 日本糖尿病合併症学会
  • Place of Presentation: 都市センターホテル(東京都千代田区)
  • Year and Date: 2014-10-03 – 2014-10-04
• [Presentation] Combinatorial therapy of cilostazol and probucol effectively reduces albuminuria through inhibition of proinflammatory pathways in podocytes. (2014)
  • Author(s): Peng He, Harukiyo Kawamura, Minoru Takemoto, Kyoko Kuno, Mayumi Shoji, Akiko Hattori, Masaya Yamaga, Kenichi Sakamoto, Emiko Okabe, Ryoichi Ishibashi, Takahiro Ishikawa, Shunichiro Onishi, Yoshiro Maezawa, Hirotake Tokuyama, Kazuki Kobayashi, Koutaro Yokote
  • Organizer: 50th EASD annual meeting
  • Place of Presentation: Reed Exhibitions Messe Wien congress center(ｳｨｰﾝ, ｵｰｽﾄﾘｱ)
  • Year and Date: 2014-09-15 – 2014-09-19
• [Presentation] Protective effect of Semaphorin 3G on atherosclerosis development. (2014)
  • Author(s): Masaya Yamaga, Harukiyo Kawamura, Kazuki Kobayashi, Hirotake Tokuyama, Takahiro Ishikawa,Ryouichi Ishibashi, Kenichi Sakamoto, Akiko Hattori, Peng He, Minoru Takemoto, Koutaro Yokote
  • Organizer: 9th Metabolic Syndrome, Type2 Diabetes and Atherosclerosis Congress
  • Place of Presentation: 京都国際会議場(京都府京都市)
  • Year and Date: 2014-09-12 – 2014-09-14
• [Presentation] 粥状動脈硬化形成におけるSemaphorin 3Gの機能解析 (2014)
  • Author(s): 山賀 政弥、河村 治清、竹本 稔、小林 一貴、徳山 宏丈、前澤 善朗、石川 崇広、石橋 亮一、賀 鵬、坂本 憲一、服部 暁子、正司 真弓、横手 幸太郎
  • Organizer: 第46回 日本動脈硬化学会総会 学術集会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル(東京都新宿区)
  • Year and Date: 2014-07-10 – 2014-07-11
• [Presentation] 腎糸球体ポドサイトにおけるシロスタゾール/プロブコールの相加的抗炎症メカニズム (2014)
  • Author(s): 賀 鵬、河村 治清、藤本 昌紀、小林 一貴、石川 崇広、大西 俊一郎、石橋 亮一、岡部 恵見子、竹本 稔、横手 幸太郎
  • Organizer: 第57回 日本糖尿病学会年次学術集会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場(大阪府大阪市)
  • Year and Date: 2014-05-22 – 2014-05-24
• [Presentation] 粥状動脈硬化形成におけるSemaphorin 3Gの機能解析 (2014)
  • Author(s): 山賀 政弥、河村 治清、竹本 稔、小林 一貴、徳山 宏丈、前澤 善朗、石川 崇広、大西 俊一郎、石橋 亮一、賀 鵬、北本 匠、坂本 憲一、服部 暁子、正司 真弓、横手 幸太郎
  • Organizer: 第57回 日本糖尿病学会年次学術集会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場(大阪府大阪市)
  • Year and Date: 2014-05-22 – 2014-05-24
• [Presentation] Protective effect of cilostazol/probucol on inflammatory kidney injury (2014)
  • Author(s): He P, Kawamura H, Kobayashi K, Tokuyama H, Ishikawa T, Onishi S, Ishibashi R, Okabe E, Kitamoto T, Sakamoto K, Yamaga M, Hattori A, Shoji M, Kuno K, Yan Kunimasa, Takemoto M and Yokote K
  • Organizer: The 18th International Vascular Biology Meeting
  • Place of Presentation: みやこメッセ(京都府京都市)
  • Year and Date: 2014-04-14 – 2014-04-17
• [Presentation] Protective effect of Semaphorin 3G on atherosclerosis development (2014)
  • Author(s): Yamaga M, Kawamura H, Kobayashi K, Tokuyama H, Ishikawa T, Onishi S, Ishibashi R, Okabe E, Sakamoto K, Hattori A, Shoji M, He P, Takemoto M and Yokote K
  • Organizer: The 18th International Vascular Biology Meeting
  • Place of Presentation: みやこメッセ(京都府京都市)
  • Year and Date: 2014-04-14 – 2014-04-17