2015 Fiscal Year Research-status Report
糖尿病病態形成ヘパトカイン・セレノプロテインPおよびその受容体の結晶構造解析
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26461328
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
菊地 晶裕 金沢大学, 医学系, 博士研究員 (90321752)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 糖尿病 / ヘパトカイン / セレノプロテイン / タンパク質結晶構造解析 / タンパク質構造モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヘパトカイン（肝臓由来の分泌タンパク質）であるセレノプロテインP（SeP）は２型糖尿病治療の新規薬剤標的となり得る。そこで、本研究ではSePのX線結晶構造解析を行い、その立体構造を基盤とした新規治療法の開発を目指している。
本年度はSePに含まれるセレノシステインをシステインの置換したシステイン置換体を用いて結晶化条件のスクリーニングを行った。システイン置換体は昨年度に構築した発現・精製系をさらに改良した。この方法で得られた精製システイン置換体はSDS-PAGEによって高純度であることが確認でき、また、CDスペクトルによって二次構造を有していることが確認できた。結晶化条件の初期スクリーニングを行ったところ、針状結晶を得ることが出来たが、回折実験に適したサイズにまでは成長しなかった。これは、システイン置換体には糖鎖が付加しており、その不均一性や運動性によることが要因と考えられる。そこで、HEK293SGnTI(-)細胞を用いて均一な糖鎖が付加したシステイン置換体の発現も試みたところ、その発現を確認することが出来た。今後、HEK293SGnTI(-)細胞を用いて発現したシステイン置換体の精製および結晶化条件のスクリーニングを行う予定である。
本年度はコンピュータによる構造予想も行った。相同性の高いタンパク質の立体構造が報告されていないために、in silicoモデルの精度は不明であるが、SePに存在するC-X-X-Cモチーフ近傍にはその配列に特徴的な構造が存在するなど、さらなる精密化を行うに値するモデルが得られたものと思われる。得られたモデルのN末端側には長いループ構造が存在し、この領域が受容体との相互作用に重要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
システイン置換体を用いることで結晶化条件のスクリーニング効率は向上したが、システイン置換体には予想外に不均一な糖鎖が修飾しており結晶化条件に再現性が必ずしもないことが進捗の遅れている大きな要因である。
そこで、HEK293SGnTI(-)細胞に一過性でシステイン置換体の発現を試みたが、HEK293細胞を用いるときに比べて発現効率が悪いことが分かった。HEK293細胞を用いる場合には一過性発現でも十分な量が精製できたが、HEK293SGnTI(-)細胞を用いる場合には安定発現株を作成する予定であり、その後の精製効率を考慮して新たにタグ付きのプラスミドを再構築する方が良いと思われる。現在、そのようなプラスミドを構築中であり、安定株作成の準備を整えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
HEK293SGnTI(-)細胞を用いて均一な糖鎖が付加したシステイン置換体の結晶化条件スクリーニングを行い結晶化条件を見出す。その際、in silicoモデルで見出されたN末端側のループ構造は結晶化に不利であることが予想されるため、ループ構造を安定化させるために受容体との複合体を結晶化に用いることも検討する。また、ヘパリンや金属イオン、さらに、本研究と関連する他の研究で作成されたSePの認識抗体などを用いることでもループ構造を安定化する効果が期待されるため、そのような複合体を用いても結晶化を試みる。
SPring-8を利用した回折実験から回折データを得ることが出来れば、分子内に存在するシステイン（硫黄原子）の単波長異常分散法（SAD）により位相決定をを行うことが可能であり、位相問題はさほど大きな障害にはならずに構造決定が行えると思われる。
システイン置換体の受容体との相互作用に関しては、結晶化のための複合体を形成させるためのみではなく、他の受容体候補の探索やSePを標的にした阻害剤の探索にも重要である。つまり、ヒト血漿から精製したネイティブのSePと同じ相互作用をするのであれば、システイン置換体を用いて他の受容体を探索したり、SePを標的とした阻害剤の探索をハイスループットスクリーニングで行うことが可能であり、結晶化とあわせて、そのような探索系構築の検討も行う。その際には、特にループ構造の領域に変異を導入し、受容体との相互作用/結合に重要なアミノ酸の同定を行うことも重要であると考えられる。
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| Causes of Carryover |
平成26年度に購入予定であった培養用インキュベーターを他の研究費で購入したことから、平成27年度に繰り越しが生じていたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
HEK293SGnTI(-)細胞でシステイン置換体の安定発現株作成および精製のためのアフィニティーカラムの購入などに使用する計画である。また、その発現効率が研究の律速となる場合にはHEK293SGnTI(-)細胞の培養をスケールアップするための機器を購入することも検討する。
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