Smad3ノックアウトマウスを用いた骨髄線維症発症機構の解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461398
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 武内 正博 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (50466702)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中世古 知昭 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (30323398) ; 大和田 千桂子 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (80436352)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 骨髄線維症

Outline of Annual Research Achievements

TEL-Lyn融合遺伝子による骨髄線維症マウスモデルの再構築を行うためにクローニングベクターに載っているTEL-Lyn融合遺伝子を切り出してレトロウイルスベクターへの載せ替えを行った。
これらのレトロウイルスベクターを、２９３gp細胞にPEI(Polyethylenimine）法でトランスフェクションし、レトロウイルスを作成し、良好なウイルス力価が得られる事を確認した。PEI法によるトランスフェクションは従来行っていたリン酸カルシウム法に比べると効率が良く、一方でリポフェクション試薬に比べるとやや効率は落ちるが試薬にかかる費用が圧倒的に安いため、以後はPEI法によるトランスフェクションを行う事とした。
Smad3ノックアウトマウスを用いた移植実験を行う上で、回収してきた骨髄細胞においてどのシグナルを解析すべきか、また、阻害薬などを用いた実験が行えないかを予測することを目的として、まず白血病細胞株において、TGFβの発現に関する経路の確認を行う事とした。PEI法にて作成したレトロウイルスを用いて、各種白血病細胞株にTEL-Lyn融合遺伝子を強制発現させる事に成功した。これらの白血病細胞株において、TGFβの発現をリアルタイムPCR法にて測定したところ、今回測定を行ったU937,K562, Jurkatのいずれにおいても優位なTGFβの発現亢進を認められなかったため巨核球系の白血病細胞株も用いてみたが、現段階では適切な細胞株が見つかっておらず、引き続き白血病細胞株における検討を行うのと同時に、他の方法（iPS細胞から作成した巨核球など）を用いる事を検討している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初予定していたTEL-Lyn融合遺伝子を含むレトロウイルスベクターがトラブルにより使用できない状態となったため、クローニングベクターに入ったTEL-Lyn融合遺伝子をレトロウイルスベクターに載せ替えを行った。また、TEL-Lynの過剰発現を行った白血病細胞株にてTGF-βの発現亢進を認めず、白血病細胞株での実験を続けるのと同時にその他の方法（iPS細胞由来の巨核球を用いるなど）を検討しているため、進捗が当初の計画よりやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

白血病細胞株での検討を引き続き行い、また、白血病細胞株以外（iPS細胞から誘導した巨核球など）でのTEL-Lyn過剰発現およびTGFβの発現亢進を確認できないか検討し、可能であれば同時進行させていく。