2014 Fiscal Year Research-status Report

MEK阻害剤を用いた移植後GVHDの選択的抑制と感染・腫瘍免疫の温存

Research Project

Project/Area Number	26461451
Research Institution	Saga University
Principal Investigator	進藤岳郎佐賀大学, 医学部, 助教 (10646706)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	木村晋也佐賀大学, 医学部, 教授 (80359794)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	造血幹細胞移植 / 移植片対宿主病（GVHD） / 抗腫瘍免疫 / MEK阻害剤
Outline of Annual Research Achievements	T細胞はその機能分化段階により、naive/central memory/effector memoryの各サブセットに分けられる。「MEK阻害剤により、naiveおよびcentral memory T細胞が選択的に抑制されるが、effector memory T細胞は温存される」という我々の報告に基づき、新規MEK阻害剤Trametinibがマウスの骨髄移植後GVHDを抑制するか否か、また抗腫瘍免疫（GVT/GVL効果）が保持されるか、解析した。 MHC半合致のBDF1モデルおよびマイナー抗原ミスマッチのB10.D2->Balb/cモデルにTrametinibを投与すると、体重減少や下痢、脱毛が軽減し、生存が延長した。病理組織学的にも、腸管粘膜の破壊や皮下組織の肥厚などの所見が軽減した。Trametinib投与でドナーT細胞の増殖と機能分化、細胞内ERKのリン酸化が抑制されたが、Foxp3陽性の制御性T細胞やB細胞の生着は温存ないし亢進した。1.0mg/kg以上の高用量投与では骨髄系造血細胞の生着が遅延したが、0.1-0.3mg/kgの低用量投与は認容された。BDF1モデルで同時にP815腫瘍細胞株を輸注すると、P815に対するドナーT細胞のアロ反応で生存が延長する（GVT効果）が、Trametinib投与時にもこの生存延長は同様に認められ、TrametinibがGVT効果を温存することが分かった。以上に関して、2015年2月の米国造血幹細胞移植学会（BMT Tandem Meetings）で発表し、現在は論文執筆中である。難治性悪性黒色腫に対するTrametinibの投与は米国で既に承認されており、その安全性は担保されている。本研究を論文化できれば、次はヒトの移植後難治性GVHD症例に対して、Trametinibを用いた臨床試験を計画する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 1. マウスGVHDの抑制に必要十分なTrametinibの投与量を決定することに関しては、0.1-0.3mg/kgを連日経口投与することでよく、この量では骨髄の生着を抑制しないことが分かった。この結果は、BDF1モデルのみならず、マイナー抗原ミスマッチモデル（B10.D2->Balb/c）でも確認することができた。これは今後ヒトにおける臨床試験をデザインするにあたって、極めて貴重な知見である。 2. Trametinib投与中のin vivoでのT細胞動態について、主にフローサイトメトリーを用いた解析により、Trametinib投与でT細胞の増殖と機能分化、ERKのリン酸化が抑制されることが分かった。これはin vitroにおける結果と一致しており、先に報告したヒトT細胞での実験結果がin vivoでも成立することを強く示唆する。病理組織学的検討でも、TrametinibがGVHDを抑制することが示され、仮説を支持する結果である。 3. Trametinibは、移植免疫において重要とされる制御性T細胞やB細胞を温存することが分かった。このことは、造血幹細胞移植における合併症を回避できるという意味で重要である。 4. マウスGVHDモデルで、腫瘍細胞株P815に対するドナーT細胞の抗腫瘍免疫（GVT効果）をTrametinibが温存することが分かった。ルシフェラーゼ導入腫瘍細胞株およびin vivo imaging system (IVIS)を用いた検討にはまだ至っていないが、腫瘍細胞株は現在準備中で、近日その検討に入れる見込みである。ウイルス特異的T細胞免疫におけるTrametinibの効果は未確認だが、現在施設内で実験系の構築に向けて準備中である。
Strategy for Future Research Activity	現在、二つのGVHDモデル（BDF1およびB10.D2->Balb/c）における検討結果、またTrametinibの適切な投与量に関する検討、さらにGVT効果に関する検討結果をまとめ、論文執筆中である。本検討が形になれば、Trametinibを用いた臨床試験の計画に入る予定である。具体的には、各種免疫抑制剤の投与にも不応の難治性GVHD患者に対してTrametinibを投与し、末梢血を用いたリンパ球サブセット解析などを行いながら、臨床効果を確認する。また一方、T/B/NKリンパ球を欠いたノックアウトマウスであるNOJマウスにヒトの単核球を輸注して作成する、xenogenic GVHDの実験系構築を進めている。本実験はヒト検体を用いたin vitroの実験結果をそのままtranslateできるという意味で貴重であり、その結果も1-2年でまとめる予定である。さらに並行して、ヒトT細胞の各memoryサブセットにおけるRas/MEK/ERK経路の蛋白発現量を測定し、各サブセットの分子生物学的差異を明らかにしたい。何らかの違いを示すことができれば、遺伝子導入ないしノックダウンによって、それぞれの生物学的特性が変容するか否か、確認する。