2014 Fiscal Year Research-status Report
AU-rich element 依存性mRNA制御と関節リウマチ滑膜細胞機能変換
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26461463
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
山崎 聡士 広島大学, 大学病院, 病院助教 (30367388)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉山 英二 広島大学, 大学病院, 教授 (70179167)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 関節リウマチ / 滑膜細胞 / サイトカイン / AU rich element / RNA結合タンパク / 3'非翻訳配列 / デュアルレポーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
関節リウマチ病態において重要と考えられる滑膜細胞を用いて、サイトカイン存在下において同細胞の遺伝子発現変換がいかにしてもたらされるのか？そのメカニズムの解明を目指している。解析技術のコンセプトとしては、関節リウマチと関連が深いサイトカイン群が滑膜細胞及ぼす影響を、mRNA発現の観点から解析するものである。本研究で取り扱う標的mRNAは、mRNAの非翻訳領域のAU-rich element (ARE) というユニークな構造を有する一群のmRNAである。AREを有するmRNA (ARE-mRNA) には関節リウマチ病態との関連を持つ分子も複数含まれ、サイトカインによる滑膜細胞の機能変換の新規機序の発見が期待される。これらのARE-mRNAに着目し、これらのmRNAのAREを含む3'非翻訳配列をレポータープラスミドにクローニングし、ルシフェラーゼを用いたスクリーニングの研究を行う。さらに、これにより選択されたARE-mRNAとmRNAを制御するRNA蛋白(RNA-BP)との結合確認、標的mRNAの半減期測定の解析を、細胞生物学的に確認していく。
平成２６年度は１０種類のサイトカインによる２３個のAREを有するmRNAへの影響をデュアルルシフェラーゼアッセイを用いてスクリーニングした。平成２７、２８年度にはAREを介してサイトカインが標的mRNAをいかにして制御するのか、その分子メカニズムを検証する研究を展開する予定である。平成２６年度はコントロールを含めた計276アッセイを完了し、目的とするサイトカインとARE-mRNAの組み合わせをの同定を行った。今後、ARE-mRNAがどのような機序でサイトカイン存在下で制御されているのか、細胞生物学的に解明していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２６年度に予定していたDual luciferase reporterを用いたスクリーニングを実施。TNFα, IL-1β, IL-6, TGFβ1, IFNγを含んだ１０種類のサイトカインを用い、これらのサイトカインに感受性を有するARE-mRNAの同定を試みた。luciferase reporterへのサブクローニングが終了している23個に関してアッセイを終了（コントロールを含んだ計276アッセイ）し、luciferase活性上昇（mRNA安定化）、luciferase活性低下（mRNA不安定化）が10%を超える組み合わせを16ペア同定した。
同定された組み合わせのペアは、サイトカインにより影響を受けるARE-mRNAである可能性が示唆され、予定していた平成２７、２８年度のメカニズム解析に供される候補の組み合わせとなる。
当初の予定通り初年度に解析対象のmRNAの選択に成功したため、研究目標の達成度を上記と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２７、２８年度における研究の推進方策は当初の予定通りの２つの研究、すなわち①サイトカイン依存性ARE-Binding proteinとARE-mRNAとの結合確認 ②標的ARE-mRNAの半減期測定 である。サイトカイン依存性ARE-Binding proteinのARE-mRNAへの結合確認は、in situ hybridization (ISH) と immunocytochemistry (ICC) を組み合わせた ISH on ICCによる検出、およびcross-link immuno-precipitation (CLIP)（ARE-mRNAとARE-BPとの結合をUVによりCross-linkした後に、ARE-BPに対する抗体を用いて免疫沈降）を行い、これにより共沈してきたRNAを、PCRやnorthern blotにより検出する方法を用いる。標的ARE-mRNAの半減期測定は、ActinomysinDを用いた内在性mRNAの経時的定量により行う。具体的には内在性ARE-BPをsiRNAを用いてノックダウンした後、ActD処理し細胞内転写を停止する。その後内在のARE-mRNAの半減期をノーザンブロットあるいは定量的PCRにより定量していく。
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