2016 Fiscal Year Research-status Report
アレルギー反応におけるRab27及びそのエフェクター分子の新奇の役割の解明
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26461484
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
奥西 勝秀 群馬大学, 生体調節研究所, 講師 (50401112)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | アレルギー / Th2 / Rab27 / 調節性分泌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、調節性分泌機構で作用するRab27関連分子に焦点を当て、アレルギー反応におけるそれらの役割を明らかにしようとするものである。H27年度までに、血球系免疫細胞に発現するRab27関連分子に関して、その遺伝子欠損マウスにおける喘息モデルの表現型を確認した。更に、骨髄キメラマウスを用いた検討を行い、Rab27関連分子のうちの２分子に関して、血球系細胞におけるその欠損により喘息様気道炎症が増悪することを確認した。
以上を踏まえ、H28年度は、この2分子に注目して、それらの作用機構の詳細を明らかにすることを試みた。まず、対象2分子のうち、血球系細胞の中では主にTh細胞に発現を認めたRab27エフェクター分子に関して、Th細胞移入の系を用いた検討を行い、遺伝子欠損マウス由来Th細胞を移入されたマウスで喘息所見の増悪を確認した。この結果から、Th細胞における当該Rab27エフェクター分子の欠損が喘息所見の増悪に重要な役割を果たしていると考えられた。更に、この遺伝子欠損マウス由来のTh細胞では、IL-33で刺激した際のIL-5の産生が著増することも確認した。他方の分子に関しては、当該分子欠損マウス由来の細胞では、野生型マウス由来の細胞と比較して、好塩基球やTh細胞では機能の差異は認めなかったが、樹状細胞ではTh1応答誘導能が低下しており、この樹状細胞によるTh1応答誘導の低下に伴い、相対的にTh2応答が亢進していることを示唆する結果を得た。すなわち、H28年度には、上記のRab27関連2分子に関して、それぞれTh細胞や樹状細胞で作用することで、Th2応答の制御に重要な役割を果たしていることを示唆する所見を得た。一方で、各分子の各細胞における作用の分子基盤はまだ完全には解明できておらず、その点はH29年度への継続課題とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H26年度は、群馬大学の動物施設のクリーンナップに伴い、マウスを一時的に実験に使用できなくなり、マウスを用いた実験を予定通りに進めることが出来なかった。その分、H27年度には、マウスを用いた実験を優先的に進めた。まず、H26年度の時点で血球系免疫細胞における発現を確認したRab27関連分子に焦点をあて、各分子の遺伝子欠損マウスの喘息モデルにおける表現型を、精力的に検討した結果、いくつかのRab27関連分子の遺伝子欠損マウスで喘息様気道炎症が増悪することを確認した。更に、骨髄キメラマウスを用いた検討を行い、2分子に関して、それらが血球系細胞で作用することでアレルギー性気道炎症を制御していることを明らかにすることが出来た。
H27年度までに得られたこれらの知見を踏まえ、H28年度には、この2分子にまず注目して、アレルギー反応におけるそれらの作用機構の詳細を明らかにする為に、各種検討を行った。その結果、アレルギー反応における各分子の標的細胞を同定することができた。すなわち、一つの分子に関しては、Th細胞で作用することでアレルギー反応を制御していることが明らかになり、他方の分子に関しては、樹状細胞で作用することでアレルギー反応を制御していることが明らかになった。更に、各分子の各細胞における作用機構の一端として、前者は、IL-33で刺激された際のTh細胞からのIL-5の分泌・産生を制御している可能性があり、後者は、樹状細胞のTh1誘導能を制御することでアレルギー反応を制御している可能性があることを明らかにした。以上の成果を踏まえると、本申請研究は、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
H29年度は、H28年度の主な研究対象であったRab27関連分子2分子に関して、その作用機序の詳細を解明する為に、次の検討を行う。1)Th細胞が主たる標的細胞である分子に関して：まず、野生型マウス由来のTh細胞と、当該分子欠損マウス由来のTh細胞とで、機能の差異を検討する。すなわち、両群間で、サイトカイン産生、各種サイトカインへの反応性（Th1, Th2, Th17 を誘導する条件に対する反応性）や、各種細胞表面発現分子（CD3, CD4, CD25, CTLA4など）の発現レベルなどの差異を、網羅的に検討する。差異を認めたものに関して、野生型マウス由来の細胞での当該Rab27関連分子のノックダウンや、遺伝子欠損マウス由来の細胞への当該分子の入れ戻しにより、同様の結果が得られるかを確認する。IL-33に対する反応性に関しては、再現性・統計学的有意差の確認の為に同様の実験を繰り返し、再現性・統計学的有意差が確認できたら、その機序解明の為に、IL-33受容体やIL-5の発現レベルを、野生型マウス由来細胞と遺伝子欠損マウス由来細胞との間で、比較検討する。2)樹状細胞が主たる標的細胞と考えられる分子に関して：まず、前述の結果、すなわち、当該分子遺伝子欠損マウス由来の樹状細胞におけるTh1応答誘導能の低下に関して、再現性や統計学的有意差の有無を確認する。再現性や統計学的有意差が確認出来たら、野生型マウス由来樹状細胞と遺伝子欠損マウス由来樹状細胞とで、Th1誘導に関連することが報告されている各種因子（IL-12, MHC-classII, microRNA含有exosomeなど）の発現や分泌の差異を検討する。樹状細胞移入の系を用いて、各マウス由来樹状細胞移入後に惹起される好酸球性気道炎症の差異を検討する。
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| Causes of Carryover |
H26年度には、群馬大学の動物施設の改修・クリーンナップに伴いマウスを用いた実験をあまり行えず、次年度使用額が生じた。H27年度には、喘息モデルの作製やその評価にはそれほど多くの試薬や測定キット等を必要とせず、また、科研費以外の資金も一部使用可能であり、次年度使用額が生じた。一方、H28年度には、それまでと比較してより多くの実験（動物実験、各種細胞単離、ELISAを用いたサイトカイン濃度測定等）を行っただけでなく、実験を迅速に効率よく進める為に研究支援者を採用した為、多大な費用が必要であったが、科研費以外の資金も一部使用可能であったため、次年度使用額を生じた。本申請研究では、これまでに得られた実験結果の再現性の確認や、細胞内におけるRab27関連分子の作用機序の詳細をより明らかにする為に、H29年度にも追加実験が必要であり、生じた次年度使用額を、この追加実験に使用する予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H29年度は、主に前述のRab27関連分子2分子に関して（可能であれば他の分子に関しても）、これまでの結果の再現性を確認する実験や、各分子の細胞内機能の詳細を解明する為の実験を行う。その為に下記に挙げる費用が必要と考えられ、次年度へ繰り越しとなった金額をそれらに使用する予定である。
1) マウス：Th細胞や樹状細胞は、プライマリーの細胞を用いて機能を検討する必要があり、各細胞の単離に用いるマウスや、また、単離した細胞を移入するマウスが必要である。更に、喘息モデルや骨髄キメラマウス作製のためのマウスも必要である。
2) 試薬：各細胞機能の評価の際に、その細胞を単離する為に、多くの試薬（例：各種細胞表面発現蛋白に対する蛍光抗体や磁気マイクロビーズ付き抗体）や機器（例：FACSやMACS）の使用料がかかり、更に、多種の生理活性物質の分泌の評価の為に、ELISAを始めとした各種測定キットが必要である。
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