プリオン高感度検出法を用いたヤコブ病タイプ鑑別診断法の開発とその分子機構の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461507
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 森 剛志 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 助教 (40426565)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 克也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (70398147)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: パネルRT-QUIC法 / 孤発性CJD

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）のタイプ分け（特にMM1とMM2）を早期に鑑別できるパネルRT-QUIC法を構築することである。RT-QUIC法は、異常型プリオン蛋白(PrP)を試験管内で増幅させる方法であり、超微量の異常型PrPが検出可能である。本法は基質としてリコンビナントPrP（recPrP）を要するが、RT-QUIC反応はこのrecPrPの配列に依存すると考えられている。そこで様々な変異recPrPを構築・精製し、プリオンタイプ特異的RT-QUIC法を構築する。
平成２６年度は、一アミノ酸を置換させた変異リコンビナントマウスPrPを作製した。変異PrPの遺伝子（マウスPrP(Q185R)、マウスPrP(Q218R)及びマウスPrP(Q218H)は当研究室に保存されている。これらの配列はPCRにより増幅後、リコンビナント作製用プラスミドpET11に挿入した。シークエンサーにより配列を確認した後、コンピテントセルBL21(DE3)に形質転換させた。これら大腸菌は大量培養し、変異recPrPを大量発現させ、精製した。
精製したrecPrPsはRT-QUIC法に用いた。ヒトプリオンによる解析を行う前にマウス順応スクレイピー株（22L及びChandler）を用いてRT-QUIC法を行った。興味深いことに、recPrPの変異箇所の違いによりRT-QUIC法感受性において異なる結果が得られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

変異recPrPの作製および解析など現在のところ計画どおりであることからおおむね順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

平成２６年度に作製した変異recPrPについて、二次構造の相違点を比較する。また、高精度のパネルRT-QUIC法を完成するために、さらに変異recPrPを構築する。一アミノ酸置換型だけでなく部分欠失型recPrPについてもいくつか作製し、RT-QUIC法を行い、MM1及びMM2を鑑別できるリコンビナントを決定する。

Causes of Carryover

平成２６年度は変異recPrPを３種作製した。現在、さらに異なる変異のrecPrPの作製を試みている。しかし、これら変異体の蛋白精製はまだ行っていない。この大量精製の際に使用するNi-NTA スーパーフローアガロースが高額であるため、次年度使用額が生じたと考えられる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

パネルRT-QUICの高精度化のためにさらに多くの変異recPrPを作製する必要がある。変異PrPの作製に使用する。