インフルエンザウイルス亜型間交叉反応性中和抗体の探索とそのエピトープ解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461517
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 大島 信子 藤田保健衛生大学, 研究支援推進ｾﾝﾀｰ最先端医療イノベーション部門, 講師 (60387694)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 交叉反応性 / 中和抗体 / ファージ抗体ライブラリー / インフルエンザウイルス

Outline of Annual Research Achievements

前年度では、A型インフルエンザウイルスH3ワクチン株に対し幅広く結合活性を示す2個の抗HA(ヘマグルチニン)抗体の単離に成功している。しかし、ワクチン株によってはスクリーニングで抗核タンパク抗体が大量に単離され、抗HA抗体の単離効率が非常に悪かった。それを改善するため、抗核タンパクを大腸菌発現系で大量に調製し、その核タンパクであらかじめ吸収させたファージ抗体ライブラリーをスクリーニングに使用した。
これまで抗核タンパクしか単離できなかった1985年および2007年H3型ワクチン株でのスクリーニングの結果、抗核タンパク抗体の単離は大幅に減少した（1985年：100％→54％, 2007年：100％→0％）。それぞれ36個、96個のクローンの重鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を確認しグループ化した。複数のH3N2株（1968年、1985年、1999年、2007年、2009年、2012年）に対する結合活性を確認したところ、すべての株に対し結合活性を示す抗体が新たに4種類取得できた。これら抗体の抗原が、インフルエンザウイルス中和抗体のターゲットであるHAであることも確認した。
これまでに単離してきた抗体は、H3株でだけではなくH1株に対する結合活性を有するものも存在している。本研究は、主としてグループ2に属する複数の亜型ウイルス株に交叉反応性を示す抗体の単離とそのエピトープ解析を目的としているが、グループ2のみならずH1、H5株が属するグループ1にも交叉結合性を示す抗体が複数単離されたことから、A型ウイルス株に対し長期的なウイルス感染予防効果がヒトに対して期待できる可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、スクリーニングでの抗HA抗体単離の成功が重要なカギを握るが、ウイルス株とファージ抗体ライブラリーの種類及びその組み合わせによっては、抗核タンパク抗体が優先して単離されるため、その確実性において十分ではなかった。これまでにH3N2株に対し幅広い交叉結合性を持つ2種類の抗HA抗体の単離に成功しており、これら抗体がグループ2に属する亜型ウイルス株に対し幅広く交叉反応性を持つ可能性がある。そのような抗体の存在する可能性をさらに追求するためには、スクリーニング時における抗核タンパク抗体の単離数を下げるための条件検討が必要となり、これに当初の予定より時間を費やした。条件検討の結果、抗核タンパク抗体の単離数の大幅な減少に成功したが、目的とする幅広い交叉結合性を持つ抗体の単離に結果としては時間がかかり、その後の解析が今年度では実施できなかった。

Strategy for Future Research Activity

幅広い交叉結合性を持つ抗HA抗体の単離に成功したことから、今後はこれら抗体の解析を中心に行う。Fab型で抗体を精製したのち、ウイルス中和活性を測定し、実際に幅広く中和する能力の有無を検討する。中和活性が検出できた抗体に対し、HIテスト（赤血球凝集抑制テスト）およびヘマグルチニンを認識する様々な抗体を用いて（それぞれに認識部位が異なる抗体である）の競合ELISA等でエピトープ解析を行い、抗原認識部位の絞り込みを行う。各抗体の中和作用機序を明らかにするとともに、グループ2およびグループ1に属する他の亜型に対する交叉反応性を検討し、ヒト体内での長期におけるウイルス感染予防効果の可能性について推察する。

Causes of Carryover

今年度は、スクリーニングの条件検討に当初の予定より時間を費やした。そのため、ファージ抗体ライブラリースクリーニング実施により単離した抗体クローンの配列解析および候補クローンの選定までは行うことができたが、それ以降の抗体クロ―ンの種々の解析が実施できず、それに使用予定であった消耗品費が未使用となった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成27年度以降の計画では、単離した抗体クローンの種々の解析を行う予定であり、今年度実施できなかったクローン解析（中和活性、HI活性、エピトープ解析および中和作用機序等)を中心に研究を行う。