次世代シーケンサーを用いたヌーナン症候群類縁疾患の網羅的遺伝子診断システムの確立

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461520
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 新堀 哲也 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40436134)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松原 洋一 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 研究所, 研究所長 (00209602) ; 青木 洋子 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80332500)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 次世代シークエンサー / ヌーナン症候群 / コステロ症候群 / CFC症候群

Outline of Annual Research Achievements

ヌーナン症候群およびその類縁疾患の次世代シークエンサー（NGS)を用いた網羅的原因遺伝子解析系の確立において、これまでのサンガー法での遺伝子診断に用いるPCRプライマーをそのまま用いて解析を行うことを目指した。各PCRプライマーにはM13forward配列またはM13reverse配列を付加しているため、以下の方法で解析を行った。1)ゲノムDNAを鋳型にMultiplex PCRにて目的領域の12遺伝子、150アンプリコンの増幅を行なった。2)M13forwardおよびreverse配列にNGSでの読み取りに必要なP5、P7およびインデックス配列を付加するため2nd PCRを行い、ライブラリを作成した。3)NGSでのシークエンスプライマーとしてM13forwardおよびreverse配列を用い、illumina Miseqで読み取りを行った。M13プライマーの塩基長を調整するなどの条件検討も行った。その結果、一部のクラスタでは塩基配列の読み取りが可能であったものの、全体のリードの質は低く、十分なリード長も得られなかった。以上よりM13プライマーをシークエンスプライマーとして十分な質・量のデータを得ることは困難と判断した。そこで、PCRアンプリコンを超音波にて断片化し、illuminaシークエンス配列のライゲーションを行い、P5,P7,インデックス配列をPCRで付加する方法に変更した。その結果、概ね良好な塩基配列データを得ることができた。4例の陽性対照における解析でも各変異の検出には成功しているが、アンプリコンの増幅高率が均等でなく、十分な量のリードでカバーされない領域が存在するため、Multiplex PCRに使用するプライマーの条件検討を行っている。これらの研究は、東北大学大学院医学系研究科倫理委員会による承認を受けている。
本手法が確立できれば、現状のサンガー法による一人ひとり、一アンプリコンずつの解析から、1回の解析により複数サンプル、12遺伝子の解析が可能となり効率化が達成できる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していた、M13配列を用いた次世代シークエンサーでの塩基読み取りは達成できなかったものの、これまで既に作成済のPCRプライマーを用いて（一部は作成し直ししているが）解析を行うことができており、さらに陽性対照の変異検出にも成功している。

Strategy for Future Research Activity

今後は更なる条件検討を行い、1)十分な信頼性で解析できていない領域をカバーするPCRプライマーの作成、2)多サンプル解析における各サンプルに必要なデータ量の測定、などを行っていく予定である。1)においても解決が困難な場合は、解析対象から外すことが必要となる可能性もある。

Research Products

• [Journal Article] Spectrum of mutations and genotype-phenotype analysis in Noonan syndrome patients with RIT1 mutations. (2016)
  • Author(s): Yaoita M, Niihori T, Mizuno S, Okamoto N, Hayashi S, Watanabe A, Yokozawa M, Suzumura H, Nakahara A, Nakano Y, Hokosaki T, Ohmori A, Sawada H, Migita O, Mima A, Lapunzina P, Santos-Simarro F, García-Miñaúr S, Ogata T, Kawame H, Kurosawa K, Ohashi H, Inoue S, Matsubara Y, Kure S, Aoki Y.
  • Journal Title: Hum Genet. Volume: 135 Pages: 209-222
  • DOI: 10.1007/s00439-015-1627-5.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Recent advances in RASopathies. (2016)
  • Author(s): Aoki Y, Niihori T, Inoue S, Matsubara Y.
  • Journal Title: J Hum Genet. Volume: 61 Pages: 33-39.
  • DOI: 10.1038/jhg.2015.114.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mutations in MECOM, Encoding Oncoprotein EVI1, Cause Radioulnar Synostosis with Amegakaryocytic Thrombocytopenia. (2015)
  • Author(s): Niihori T, Ouchi-Uchiyama M, Sasahara Y, Kaneko T, Hashii Y, Irie M, Sato A, Saito-Nanjo Y, Funayama R, Nagashima T, Inoue S, Nakayama K, Ozono K, Kure S, Matsubara Y, Imaizumi M, Aoki Y.
  • Journal Title: Am J Hum Genet. Volume: 97 Pages: 848-854
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2015.10.010.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Adult mice expressing a Braf Q241R mutation on an ICR/CD-1 background exhibit a cardio-facio-cutaneous syndrome phenotype. (2015)
  • Author(s): Moriya M, Inoue S, Miyagawa-Tomita S, Nakashima Y, Oba D, Niihori T, Hashi M, Ohnishi H, Kure S, Matsubara Y, Aoki Y.
  • Journal Title: Hum Mol Genet. Volume: 24 Pages: 7349-7360
  • DOI: 10.1093/hmg/ddv435.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Somatic BRAF c.1799T>A p.V600E Mosaicism syndrome characterized by a linear syringocystadenoma papilliferum, anaplastic astrocytoma, and ocular abnormalities. (2015)
  • Author(s): Watanabe Y, Shido K, Niihori T, Niizuma H, Katata Y, Iizuka C, Oba D, Moriya K, Saito-Nanjo Y, Onuma M, Rikiishi T, Sasahara Y, Watanabe M, Aiba S, Saito R, Sonoda Y, Tominaga T, Aoki Y, Kure S.
  • Journal Title: Am J Med Genet A. Volume: 170 Pages: 189-194
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.37376.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A postzygotic NRAS mutation in a patient with Schimmelpenning syndrome. (2015)
  • Author(s): Kuroda Y, Ohashi I, Enomoto Y, Naruto T, Baba N, Tanaka Y, Aida N, Okamoto N, Niihori T, Aoki Y, Kurosawa K.
  • Journal Title: Am J Med Genet A. Volume: 167A Pages: 2223-2225
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.37135.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genomic analysis identifies candidate pathogenic variants in 9 of 18 patients with unexplained West syndrome. (2015)
  • Author(s): Hino-Fukuyo N, Kikuchi A, Arai-Ichinoi N, Niihori T, Sato R, Suzuki T, Kudo H, Sato Y, Nakayama T, Kakisaka Y, Kubota Y, Kobayashi T, Funayama R, Nakayama K, Uematsu M, Aoki Y, Haginoya K, Kure S.
  • Journal Title: Hum Genet. Volume: 134 Pages: 649-658
  • DOI: 10.1007/s00439-015-1553-6.
  • Peer Reviewed