Basic studies toward CRISPR/Cas9-mediated cell therapy

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26461530
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 宮下 俊之 北里大学, 医学部, 教授 (60174182)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: PTCH1 / 髄芽腫 / LOH / モザイク / iPS細胞

Outline of Annual Research Achievements

ソニックヘッジホッグの抑制性受容体をコードするPTCH1遺伝子の変異で発症する常染色体優性遺伝病である母斑基底細胞癌症候群（NBCCS）の患者3名の線維芽細胞からiPS細胞を樹立した。樹立したiPS細胞は一部（後述）を除いて血液と同一の胚細胞変異をもっていた。また健常人由来iPSと同様の未分化性を示し、PTCH1の変異をもつにもかかわらず、増殖能に差がみられなかった。
免疫不全マウスにこのiPS細胞を移植したところ、発生した全ての奇形腫に、NBCCSで好発する髄芽腫様組織が認められた。このような組織は健常人由来iPS細胞の移植では全く発生しなかった。この組織ではTuj-1、Synaptophysin、Nestinなどの髄芽腫のマーカーが陽性であった。更に、レーザーマイクロダイセクション法で奇形腫1例から上記組織部分を採取し遺伝子解析を行なったところ、胚細胞変異に加えて、PTCH1の正常アレルの消失（LOH）が認められたことから、NBCCSで発症する腫瘍と同様の機序で髄芽腫が発症していることが明らかとなった。
以上より、本研究でヒト髄芽腫モデルが確立できたと考えられ、今後髄芽腫に対するプレシジョン・メディシンへの応用が期待される。またCRISPR/Cas9システムを用いて、残る正常アレルにも変異を導入したiPS細胞を作製することで、さらに効率よく髄芽腫を発生させられる可能性がある。また皮膚の基底細胞に分化させる方法を確立できれば、NBCCSで好発する基底細胞癌の疾患モデルの確立も期待される。
一方、樹立したiPS細胞株の一部に胚細胞変異と異なる変異が検出されたため、その株が由来する症例の線維芽細胞と末梢血のゲノムDNAを次世代シーケンサーで解析したところ、この症例は、本疾患では未報告のモザイク症例であることが証明でき、その発症機序として、極めてまれな復帰エラーが推測された。

Research Products

• [Journal Article] Somatic mosaicism containing double mutations in PTCH1 revealed by generation of induced pluripotent stem cells from nevoid basal cell carcinoma syndrome. (2017)
  • Author(s): Ikemoto, Y., Takayama, Y., Fujii, K., Masuda, M., Kato, C., Hatsuse, H., Fujitani, K., Nagao, K., Kameyama, K., Ikehara, H., Toyoda, M., Umezawa, A. and Miyashita, T.
  • Journal Title: Journal of Medical Genetics Volume: － Pages: －
  • DOI: 10.1136/jmedgenet -2016-104490
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Brain morphology in children with nevoid basal cell carcinoma syndrome. (2017)
  • Author(s): Shiohama, T., Fuji, K., Miyashita, T., Mizuochi, H., Uchikawa, H., Shimojo, N.
  • Journal Title: American Journal of Medical Genetics A Volume: 173 Pages: 946-952
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.38115
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Nevoid basal cell carcinoma syndrome caused by splicing mutations in the PTCH1 gene. (2017)
  • Author(s): Kato, C., Fujii, K., Arai, Y., Hatsuse, H., Nagao, K., Takayama, Y., Kameyama, K., Fujii, K., and Miyashita, T.
  • Journal Title: Familial Cancer Volume: 16 Pages: 131-138
  • DOI: 10.1007/s10689-016-9924-2
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 角化嚢胞性歯原性腫瘍を合併したB前駆細胞型急性リンパ性白血病の一例 (2016)
  • Author(s): 渡邊敦、杣津晋平、大城浩子、赤羽弘資、合井久美子、犬飼岳史、藤井克則、宮下俊之、杉田完爾
  • Organizer: 第58回日本小児血液・がん学会学術集会
  • Place of Presentation: 品川プリンスホテル（東京都港区）
  • Year and Date: 2016-12-15 – 2016-12-17
• [Presentation] Gorlin症候群患者由来iPS細胞を用いた髄芽腫の作製 (2016)
  • Author(s): 池本 優、豊田 雅士、那須 道世、初瀬 洋美、長尾 和右、高山 吉永、亀山 孝三、梅澤 明弘、宮下 俊之
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] Entire PTCH1 deletions detected in 9 families with nevoid basal cell carcinoma syndrome (2016)
  • Author(s): 高山吉永、長尾一右、藤井克則、宮下俊之
  • Organizer: 第75回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（横浜市）
  • Year and Date: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [Presentation] Gorlin症候群における脳形態解析－ヘッジホッグシグナルのヒト脳への影響－ (2016)
  • Author(s): 塩浜直、藤井克則、宮下俊之、内川英紀、水落弘美、池原甫、福原知之、下条直樹
  • Organizer: 第58回日本小児神経学会学術集会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2016-06-03 – 2016-06-05
• [Book] 最新遺伝性腫瘍・家族性腫瘍研究と遺伝カウンセリング (2016)
  • Author(s): 宮下俊之、藤井克則
  • Total Pages: 336
  • Publisher: メディカルドゥ
• [Remarks] 北里大学医学部分子遺伝学
  • URL: http://www.med.kitasato-u.ac.jp/~molgen/