2015 Fiscal Year Research-status Report
ペルオキシソーム病患者血清の新規脂質分子に着目した病態解明と臨床指標への医用展開
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26461532
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
横山 和明 帝京大学, 薬学部, 教授 (50246021)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 極長鎖脂肪酸 / リピドミクス / メタボローム / ペルオキシソーム病 / 副腎白質ジストロフィー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の実施項目は、１解析系の構築、２リピドミクス解析、３ターゲット分子のサンプル中での存在様式と代謝系の解析、４診断マーカーの探索、の４つを計画しており、申請時に記載したホスファチジルセリンに加え、より広範な脂質クラスについて解析を実施している。
平成２７年度の実施概要は以下の通りである。解析系の構築では、定量解析と構造解析の測定系を目指しており、脂質定量解析では三連四重極型モードでLC-MS/MSを用い、脂質クラスごとに極性基に特徴的なフラグメントイオンと想定される親イオンでMRM解析を網羅的に行い定量する系を構築した。ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシートール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンについて測定が可能となった。脂質構造解析ではイオントラップ型モードでLC-MS/MSを用い、上記グリセロリン脂質のうち定量解析で差があったシグナルについて、脂肪酸とリゾ体のプロダクトイオンを測定し構造が決定できるような測定系がほぼ構築できた。糖脂質に関しては、既知標品の質量分析計の解析条件をほぼ確定することができた。天然由来サンプルを用いたリピドミクス解析への適用に関しては、高速液体クロマトの分離条件の確立が必要であり、引き続き検討中である。ターゲット分子の代謝解析については、ALDの原因遺伝子ABCD1の欠損細胞を樹立した。診断マーカーに関しては、疾患サンプルでの解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
解析系の構築はリン脂質、リゾリン脂質、糖脂質、アシルCoA、中性脂質を主な対象としている。脂質定量解析については、リン脂質に関しては完了した。それ以外の脂質についても条件検討を進めている。手法としては選択性と感度に優れるMRM解析を網羅的に行うが、その前提として各脂質の脂質構造解析系で得られるプロダクトイオンパターンが必要であり、その中で効率のよいものを選んでMRMを組む必要があるため、構造解析系の確立が必要である。ここでプロダクトイオンパターンの解析し構造を推定する。論文的にも確定していなかった糖脂質やアシルCoA、中性脂質の解析条件ついてほぼ確定することができた。ただし糖脂質に関しては高速液体クロマトの分離条件を検討中である。構造解析についてはグリセロリン脂質は脂肪酸とリゾ体のフラグメントイオンを測定し構造が決定できるような測定系が構築できた。スフィンゴミエリンについては、LC-MS/MS/MSを用いてより詳細な解析が必要であることが判明し系を構築した。
リピドミクス解析については、患者サンプルに先立ちノックアウト(KO)マウスの脳を用いて定量解析を行った。その結果に基づく構造解析を実施中であり、KOマウスと正常マウス各４例の脳を用いて、上記各リン脂質クラスについて定量解析を行った。その結果、約500近くのシグナル中、ノックアウトマウスで選択的に増加しているシグナル数十個と減少しているシグナル十数個を検出した。これは当初の計画通りである。
ターゲット分子の代謝解析については、各種ヒト細胞を検討した結果、HeLa細胞をベースとしてABCD1の欠損細胞を樹立した。
ALD発症前診断マーカーの探索に関しては患者サンプルを用いて予備的に実施中であり、ほぼ計画の通りである。
以上より一部が予定より遅れているものの、全般としてはほぼ計画に沿うものである。
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| Strategy for Future Research Activity |
解析系の構築では引き続き糖脂質の分離系の構築を進め、その結果を踏まえてMRMを用いた定量系を確立する。また糖脂質、アシルCoAについては生体サンプルからの抽出法とLCでの分離系についても検討していく。
リピドミクス解析については、解析系が確立した脂質について、KOマウスの各種臓器について解析し、より微量な患者サンプルについても解析する。またABCD1欠損細胞についても解析し、KOマウスや患者血液と脂質パターンの異同について比較検討する。
ターゲット分子のサンプル中での存在様式と代謝系の解析については、ABCD1欠損細胞を用いて極長鎖脂肪酸含有脂質分子種の生合成酵素について検討していく。
診断マーカーに関しては、患者サンプルのうち発症者のものと発症前の患者のもの比較検討することにより、差のあるものについて検討する。
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| Causes of Carryover |
平成28年度に購入を予定した試薬等の１件の金額がB-Aを超えるので次年度に購入することとしたため、繰り越すこととなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度交付予定の120万円と合わせて使用する予定である。
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