2015 Fiscal Year Research-status Report
造血幹細胞移植後EBV関連リンパ増殖症に対するEBV特異的CTL療法の最適化
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26461580
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
高橋 義行 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40432273)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小島 勢二 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20313992)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 小児血液学 / 造血幹細胞移植 / ＥＢウイルス / ＣＴＬ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）造血幹細胞移植後にEBV再活性化およびウイルス特異的CTL体内動態の観察：90例以上の移植後患者末梢血液中EBV-DNA定量を行い、ATG血中濃度をELISA法により測定し、EBV再活性化との関連を検討した。またEBV再活性の新規症例においては、Rituxan投与前後にフローサイトメトリー法による末梢血中のリンパ球サブセットの解析を行い、CD20陰性CD19陽性細胞の有無を同定した。Rituxan投与後にEBV-DNA増加症例においては、EBERに対するプローブを用いたフローサイトメトリーFISH法を用いてEBV感染細胞の同定、EBV特異的CTLテトマラー染色によりEBV特異的CTLのモニタリングが可能となった。
２）EBV特異的CTL存在下で発症するEB-LPDにおけるエスケープメカニズムの検討：造血幹細胞移植後に体内にEBV特異的CTLが存在しながら免疫抑制剤を中止してもEB-LPDが縮小しない症例を経験し、LMP2,EBNA3A,EBNA3BといったEBV抗原発現について発現が消失していることを確認した。（亀井、高橋ら、日本血液学会東海地方会、名古屋、2015年5月23日報告した）
３）HLA-A0201/0206,A2402以外のHLA拘束性EBV抗原ペプチドによる対象HLAの拡大：現在当院で行っている「同種造血幹細胞移植後において生じるEBV関連リンパ球増殖症に対するEBV抗原特異的CTLを用いた治療の安全性に関する臨床第I相試験」で用いられているEBV抗原ペプチドはHLA-A0201/0206,A2402拘束性であるが、HLA-A11拘束性ペプチドを合成し、新たにEBV特異的CTLとして培養可能であった。
４）第3者由来末梢血からEBV特異的CTLを培養し、凍結保存しておき、移植後リツキシマブ抵抗性EB-LPDに投与する第Ｉ相試験が再生医療新法に基づいて承認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当院では小児に対する造血細胞移植施設として、年間移植数が全国で最も多く、抗胸腺グロブリンを用いたＨＬＡハプロ一致移植といった移植後ＥＢＶ再活性化リスクの高い移植も多く行っており、順調に研究に必要な検体が確保できている。さらに第3者由来EBウイルス特異的ＣＴＬ療法の第Ｉ相試験が再生医療新法に基づき承認され、開始できた。
１）造血幹細胞移植後にEBV再活性化およびウイルス特異的CTL体内動態の観察：移植後患者末梢血液中EBV-DNA定量を行い、ATG血中濃度をELISA法により測定し、EBV再活性化との関連を検討した。末梢血中のリンパ球サブセットの解析によるCD20陰性CD19陽性細胞の同定、EBERに対するプローブを用いたフローサイトメトリーFISH法を用いたEBV感染細胞の同定、EBV特異的CTLテトマラー染色により患者体内のEBV特異的CTLのモニタリング可能。
２）EBV特異的CTL存在下で発症するEB-LPDにおけるエスケープメカニズムの検討：造血幹細胞移植後に体内にEBV特異的CTLが存在しながら免疫抑制剤を中止してもEB-LPDが縮小しない症例を経験し、LMP2,EBNA3A,EBNA3BといったEBV抗原発現について発現が消失していることを確認した（亀井、高橋ら、日本血液学会東海地方会、名古屋、2015年5月23日報告した）。
３）HLA-A0201/0206,A2402以外のHLA拘束性EBV抗原ペプチドによる対象HLAの拡大：「同種造血幹細胞移植後にEBV抗原特異的CTLを用いた治療の安全性に関する臨床第I相試験」において新規HLA-A11拘束性ペプチドを合成し、新たにEBV特異的CTLとして機能することを確認でき、第3者由来EBウイルス特異的ＣＴＬ臨床第Ｉ相試験においても対象ＨＬＡが拡大できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）造血幹細胞移植後にEBV再活性化およびウイルス特異的CTL体内動態の観察
引き続き移植後の患者末梢血液中においてEBV-DNA定量を行い、ATG使用例においてDay７、Day14、Day28の保存血清中のATG血中濃度をELISA法により測定し、EBV再活性化との関連を検討する。またEBV再活性の新規症例においては、Rituxan投与前後にフローサイトメトリー法による末梢血中のリンパ球サブセットの解析を行い、CD20陰性CD19陽性細胞の有無を同定する。Rituxan投与後にEBV-DNA増加症例においては、EBERに対するプローブを用いたフローサイトメトリーFISH法を用いてEBV感染細胞の同定を行い、EBV特異的CTLテトマラー染色により患者体内のEBV特異的CTLのモニタリングを行う。これらの因子がEB-LPDの発症予測、および治療の有効性予測に有用であるかどうかを明らかにする。
２）EBV特異的CTL存在下で発症するEB-LPDにおけるエスケープメカニズムの検討
造血幹細胞移植後に体内にEBV特異的CTLが存在しながら免疫抑制剤を中止してもEB-LPDが縮小しない症例では、EB-LPDと診断されたリンパ節生検からDNAを抽出し、HLAをタイピングし、HLA-LOHについて同定し、SNPアレイ法によりHLAをコードする6番染色体短腕上のUniparental disomy（UPD）について検討する。HLA欠失のない症例ではLMP2,EBNA3A,EBNA3BといったEBV抗原発現についてRT-PCR法を用いて検討する。
３）第3者ドナーからのEBウイルス特異的CTL療法の開始
ウイルス特異的CTL療法適応症例の最適化および対象HLA拡大による患者リクルートを行い、第I相試験を開始した。移植研究班、学会を通じてアナウンスし症例を蓄積する。
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| Causes of Carryover |
第3者ウイルスＣＴＬ療法が再生医療新法に承認されたが、書類、体制整備のため研究開始が遅れたため、次年度使用に研究費を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ウイルス特異的CTL培養、のため細胞培養試薬（培地、抗生物質など）およびサイトカイン（IL-2）が必要である。フローサイトメトリー関連試薬としてモノクローナル抗体、モノクローナル抗体磁気ビーズ、フローシース液が必要である。CTL細胞によるEBV感染細胞障害活性試験を行うためCr release assay用の５１Crが必要である。また培養、フローサイトメトリーに使用するフラスコ、96穴プレート、チップ、FACS用チューブが必要である。海外発表、資料収集、成果発表のために旅費が必要である。
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[Journal Article] Virological analysis of inherited chromosomally integrated human herpesvirus-6 in three hematopoietic stem cell transplant patients.2015
Author(s)
Miura H, Kawamura Y, Kudo K, Ihira M, Ohye T, Kurahashi H, Kawashima N, Miyamura K, Yoshida N, Kato K, Takahashi Y, Kojima S, Yoshikawa T.
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Journal Title
Transpl Infect Dis.
Volume: 17
Pages: 728-731
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Fulminant adenovirus hepatitis after hematopoietic stem cell transplant: Retrospective real-time PCR analysis for adenovirus DNA in two cases.2015
Author(s)
Kawashima N, Muramatsu H, Okuno Y, Torii Y, Kawada JI, Narita A, Nakanishi K, Hama A, Kitamura A, Asai N, Nakamura S, Takahashi Y, Ito Y, Kojima S.
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Journal Title
J Infect Chemother.
Volume: 21
Pages: 857-863
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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