2014 Fiscal Year Research-status Report
分子病態に基づく血球貪食性リンパ組織球症の新規診療基盤開発
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26461582
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
八角 高裕 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00511891)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 血球貪食性リンパ組織球症 / 迅速スクリーニング / 機能病態解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血球貪食性リンパ組織球症（HLH）の病態を解明する為、以下の項目について研究・解析を行った。
A）機能解析・蛋白発現解析・全既知遺伝子解析による原発性HLHスクリーニング：当科に寄せられたHLH症例に対して、①NK細胞及びCTLの脱顆粒機能解析、②FHL責任分子の蛋白発現解析、③既知の原発性HLHの遺伝子解析(PRF1/UNC13D/STX11/STXBP2/SH2D1A/BIRC4/ITK)による網羅的解析を行った所、本邦に於けるFHLのスクリーニングとしては②のみでほぼ充分である事が判明した。但し、BIRC4欠損症には非常に軽症な症例が存在する為、遺伝子解析が必要であることが判明した。
B）既知FHL遺伝子変異の機能解析系の確立：ヒトNK細胞株(KHYG1)及びCTL細胞株（TALL-104）をもとに、UNC13D exon 1の開始コドン近傍の下流に配列特異的な人工DNAヌクレアーゼであるTALEN及びCRISPR/Cas9の標的部位を設定し、それぞれ設計・発現ベクター作成を行った。同時にターゲティングベクターとして同標的部位の両側1kbsの相同配列を持つピューロマイシン耐性遺伝子ユニットのコンストラクトを作成し、Electroporation法を用いた二重鎖切断とターゲティングベクターの共導入によるUNC13D遺伝子ノックアウトと薬剤耐性ユニットの組み込みを行った。但し、TALL-104に関して増殖が悪く欠損細胞株の確立が難しい状況であり、現在はKHYG1細胞株を中心に作成を進めている状況である。
C）HLH患者由来iPS細胞ライブラリーの作成：FHL3患者1名よりiPS細胞を確立した。
D）バイオマーカー解析によるHLH病態解析：HLH症例の凍結保存血漿を用いて蛍光マイクロビーズを用いた網羅的サイトカイン検索を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
A）原発性HLHスクリーニングに関してはかなり確立した系が構築されており、順調に症例の集積が進んでいる。
B）既知FHL遺伝子変異の機能解析系の確立に関しては、DNA編集技術はほぼ確立しているものの、元となる細胞株の増殖が悪く、目的とするFHL責任遺伝子欠損細胞株の確立には至っていない。機能解析対象となる変異UNC13D遺伝子コンストラクトは作成済みであり、細胞株が樹立すれば機能解析はすぐにでも行える状態である。
C）HLH患者由来iPS細胞ライブラリーの作成に関しては、FHL3患者由来のiPS細胞株が樹立されているが、そこからCTLやNK細胞への分化系が確立されていない。
D）バイオマーカー検索に関しては、保存血漿サンプルを用いて蛍光マイクロビーズによる網羅的サイトカイン検索を行ったが、検体採取の時期や保存方法が統一されておらず充分な解析が行えなかった。
上述の通り、一部の項目に問題があり予定通りに進んでいない為、全体として研究予定よりやや遅れている。ただし、各々の問題点を改善・克服する方策を検討中であり、今後の進展が期待できる状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度は以下の項目別に解析を行い、HLHの病態解析とそれに基づいた疾患細分化を進める。
A）原発性HLHのスクリーニングはこのまま症例を集積し、一般検査データと臨床情報の集積を継続すると同時に、病態解析に使用する検体の採取・保存を行う。
B）既知FHL遺伝子変異の機能解析系の確立には、責任遺伝子欠損細胞株の樹立が重要である。現在用いているTALL-104の増殖が悪い事が問題である為、増殖を促進する遺伝子の導入や、もともと増殖の良い他の細胞株の使用、患者由来CTLをトランスフォームする方法などを検討し、早期にFHL遺伝子変異の機能解析系を確立する。
C）HLH患者由来iPS細胞ライブラリーの作成に関しては、引き続き症例を集積してiPS細胞を作成すると同時に、CTLやNK細胞の誘導系を確立する。
D）細胞機能・バイオマーカー・トランスクリプトーム解析によるHLH病態解析：検査依頼症例からの検体採取・保存方法を均一化してトランスクリプトームやプロテオーム解析を行う。加えて、患者由来のアロ抗原特異的CTL細胞ラインの確立が可能となったため、条件の均一な細胞株を用いたバイオマーカー検索を行う。
E）エクソーム解析による新規責任遺伝子の同定：集積した症例から幾つかのHLHサブグループとして分類された症例毎にエクソーム解析を行い、遺伝子変異を網羅的に解析して新規HLH責任遺伝子の同定を目指す。
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| Causes of Carryover |
既知FHL遺伝子変異の機能解析系の確立を進めているが、現在用いているTALL-104細胞株の増殖が悪く、クローニングが行えていない状況である。この為、当初予定していた細胞傷害活性測定実験が行えておらず、解析に必要な試薬代が残った状況である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在費用しているTALL-104に代わる細胞株の使用や、培養条件の変更、増殖促進因子の導入により機能解析系の確立を進めている。加えて、患者由来CTL細胞ライン株を用いた細胞傷害活性測定の準備が整っており、次年度には予定通りの試薬の購入を予定している。
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