ダイヤモンド・ブラックファン貧血の新規動物モデル作製と治療法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461596
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 三宅 弘一 日本医科大学, 医学部, 准教授 (90267211)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: リボゾーム蛋白質 / ダイヤモンド・ブラックファン貧血 / レンチウイルスベクター / siRNA

Outline of Annual Research Achievements

ダイヤモンド・ブラックファン貧血(DBA)の病因に関してはいまだ完全には解明されておらずRPS19リボゾームタンパク質を始めとしてRPL5, RPL11, RPS24, RPS17 などの様々なリボゾームタンパク質の異常が報告されてはいるが、その病態は依然として不明な事が多く、現在までに有効な治療法は開発されていない。DBA研究の問題点として(1)DBAの患者数が少なく研究に必要なサンプルが手に入りにくい。(2) DBAの細胞自体がin vitroにて増殖が困難である。(3) DBAの病態解析、治療効果検討を行えるモデルが存在しない。などがあげられる。これらの理由からDBAの病体解析およびその治療法の研究をするのは困難であった。本研究ではDBAのモデルマウス作製を目的とし、現在までにリボゾーム蛋白に対するsiRNAを発現する薬剤(テトラサイクリン)誘導性レンチウイルスベクターを作製済するとともに、KRAB遺伝子をすでに組み込んだマウス（KRABマウス）を作製した。KRABマウスより骨髄細胞を摂取し、各リボゾーム蛋白に対するsiRNAを発現するレンチウイルスベクターにて遺伝子導入後移テトラサイクリン投与にて薬剤誘導性を検討した所、遺伝子導入効率が低値であったため、レンチウイルスベクターを濃縮し力価を上げ導入を行った。導入効率の上昇は見られたが、(1)テトラサイクリン投与以前より発現が認められる。(2)テトラサイクリンによる誘導率が低い。などの問題点が見られた。原因追及のためKRABマウスのKRAB遺伝子の発現を検討したところ発現は認められたが、より高発現のマウス選択し再度検討を行っていく予定でいる。また、このKURABマウスを用いたモデル動物作製が困難な場合にはCRISPR-Cas9システムを用いたトランスジェックモデルマウスも検討していく。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

KRABマウスの骨髄細胞にsiRNAとGFPを発現するレンチウイルスベクターにて遺伝子導入し、テトラサイクリン投与にて薬剤誘導性を検討した所、(1)テトラサイクリン投与以前より発現が認められる。(2)テトラサイクリンによる誘導率が低い。などの問題点が見られた。この問題点を解決すべくKRAB高発現のKRABマウスの選択を行っており、マウスの増殖も悪く好条件のマウスの確保が遅れているため。

Strategy for Future Research Activity

レンチウイルスベクターにて遺伝子導入後のテトラサイクリン薬剤誘導率を向上させるためにKRABマウスのKRAB発現の検討などを行っていく。また、このKURABマウスを用いたモデル動物作製が困難な場合にはCRISPR-Cas9システムを用いたトランスジェックモデルマウスも検討していく。

Causes of Carryover

KRABマウスの骨髄細胞にsiRNAとGFPを発現するレンチウイルスベクターにて遺伝子導入し、テトラサイクリン投与にて薬剤誘導性を検討した所、(1)テトラサイクリン投与以前より発現が認められる。(2)テトラサイクリンによる誘導率が低い。などの問題点が見られた。この問題点を解決すべくKRAB高発現のKRABマウスの選択を行っており、マウスの増殖も悪く好条件のマウスの確保が遅れ当該年度の実験施行が遅れたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

KRAB高発現のKRABマウスの選択が出来次第実験の継続を行うとともに、KURABマウスを用いたモデル動物作製が困難な場合にはCRISPR-Cas9システムを用いたトランスジェックモデルマウスの作製を行っていく。

Research Products

• [Journal Article] Improved Intravitreal AAV-Mediated Inner Retinal Gene Transduction after Surgical Internal Limiting Membrane Peeling in Cynomolgus Monkeys (2017)
  • Author(s): Takahashi K, Igarashi T, Miyake K, Kobayashi M, Yaguchi C, Iijima O, Yamazaki Y, Katakai Y, Miyake N, Kameya S, Shimada T, Takahashi H, Okada T.
  • Journal Title: Mol Ther. Volume: 25 Pages: 296-302
  • DOI: 10.1016/j.ymthe.2016.10.008.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tyrosine triple mutated AAV2-BDNF gene therapy in a rat model of transient IOP elevation (2016)
  • Author(s): Igarashi T, Miyake K, Kobayashi M, Kameya S, Fujimoto C, Nakamoto K, Takahashi H, Igarashi T, Miyake N, Iijima O, Hirai Y, Shimada T, Okada T, Takahashi H.
  • Journal Title: Mol Vis. Volume: 16 Pages: 816-826
  • Peer Reviewed