2015 Fiscal Year Research-status Report
低酸素性虚血性脳症に対する新規トロンボモジュリンによる脳保護作用の解明
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26461640
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
高橋 幸博 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (60142379)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 低酸素虚血性脳症 / トロンボモジュリン / 脳保護作用 / ラット / 内頚動脈永久結紮モデル / プロテインC / 活性化プロテインC / アンチトロンビン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低酸素虚血性脳症へのトロンボモジュリン(TM)の脳保護作用を検討するため、Koizumi Jらの方法に準じラットを用い右内頚動脈永久結紮モデルで検討した。結紮後にTM投与群（3.6mg/kg）と非投与群とに分け、6時間後と24時間後でPetullo Dの方法による運動麻痺の評価、2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride （TTC）染色による脳壊死病巣の広がりを計測した。結紮後6時間でTM投与群と非投与群との傷害部位を皮質部位領域と線条体部位領域とに分け解析した。線条体部位領域では差異がなかったが、皮質部位領域で有意に神経保護効果が観察された。また、24時間後で皮質壊死での差異は乏しかったが、有意に運動機能の改善が観察された。さらに、TM投与群は非投与群に比して脳浮腫の有意な軽減効果が観察された。今回の結果からTMはNedelcu J らの観察したラット脳血流障害モデルの６時間後、２４時間後の二相性の脳浮腫Pediatr Res.1999 46:297-304）の両相に改善効果を示すと考えられた。今年度の実験を進めるにあたり、新生児仮死に伴う新生児DIC症例の脳MR画像、精神運動機能を評価し、傷害群と非傷害群で入院時の血液ガス、止血検査成績を比較した。傷害群では有意に乳酸値が高値を示し、活性化部分トロンボプラスチン時間が有意に延長し、アンチトロンビン（AT）が有意に低下していた。TMはトロンビンと複合体を形成しプロテインS（PS）とともにプロテインC（PC）を活性化プロテインC（APC）に変換する。APCは抗凝固作用に加え、抗炎症作用、さらに脳保護作用を示すことが報告されている。TMの脳保護作用が①直接的（脳にTMが高発現）、②APCを介するかAPCとの強調作用、③PC、PS、ATなどとの相乗効果が考慮される。これらを踏まえ引き続き実験を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新生児仮死の低酸素性虚血性脳症へのTMの脳保護効果を想定し、総頚動脈結紮および低酸素負荷による古典的なRice 3rd JEの幼弱ラットモデルで実験を重ねた。しかし、脳壊死部位の再現性が約60%と満足できるものでなく、個体差および脳血管バイパスの関与が推定された。TMの脳保護効果を確認するため、再現性が高い成熟ラットを用いた右内頚動脈永久結紮モデルで実験を行いTM投与による有意な脳保護効果を確認した。しかし、TMの脳保護作用機序の解明に脳組織レベルを含めた追加実験が必要であること、当初の作業仮説でもある幼弱ラットでの脳保護効果を検証する必要がある。実験遂行に再度新生児仮死に伴う新生児DICへのTM投与による脳保護効果を脳MR画像、神経運動機能から検証した。TM投与により明らかに予後改善がみられたが、傷害を残した群の結果からTM投与法、他の治療法との併用療法が必要と想定された。追加実験に際し、脳病理解析、TM投与法についても検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験遂行にあたり旭化成ファーマとTM提供の契約はすでに完了した。実験モデル作成はTM入手の契約およびモデル実験作成手技協力から前回実験を行った日精バイリスで実施を行う。解析はNIH Image Jを用いる。病理切片での免疫染色をあわせ実施する。
研究計画の遂行、動物倫理委員会への申請にあたり、日精バイリスと成熟ラットでの右内頚動脈永久結紮および虚血再灌流実験モデルラット作成のための研究方法について協議し、その後、日精バイリスでの動物倫理委員会ならびに奈良県立医科大学実験動物倫理委員会への申請および許可を得て実験を行う。方法はPetullo Dの方法による運動麻痺の評価、2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride （TTC）染色による脳壊死病巣評価および脳病理免疫染色。実験計画 ① TM投与法の検討としてラットDICモデルでのTM投与量1回量3.0mg/kg（前回実験に用いた投与量）と6時間後での脳浮腫軽減のため、初回量を半量1.5mg/kgとし結紮後6時間目に同量の追加投与を行い24時間後で非投与群と比較 ② 虚血再灌流試験として右内頚動脈にシリコンコーチングした4.0ナイロン糸を仮結紮後、TM投与を投与し、一定時間後 (1時間) にテフロン糸を抜去し24時間に非投与群と比較 ③ 多剤併用療法として新生児DICでも併用するヒトAT製剤 (70単位/kg)あるいはPPSB製剤中のPC（新鮮凍結血漿からPC生成予定）を比較 以上を予定している。なお、遂行には各ステップでのデータ解析後をもって進捗を行う。
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| Causes of Carryover |
当初の計画では新生児仮死児で観察した低酸素性虚血性脳症へのトロンボモジュリンの脳保護作用を検討する目的から、すでに幼弱ラットモデルで報告のあるRice 3rd JEらの方法に準拠し、幼弱ラットの総内頚動脈結紮、低酸素負荷による脳傷害モデルで検討を行った。しかし、脳虚血壊死の発生頻度が60%程度と種あるいは血管バイパスの影響はが、本研究でトロンボモジュリンの脳保護作用として有意差を求めるには多くの幼弱ラットを必要とすることが判明した。また、投与するトロンボモジュリン薬が高価であることから、本研究を継続するにあたり再検討を重ね、より確実な動物モデルとして内頚動脈までシリコンコーチングしたナイロン糸を挿入し、また、完全に血流遮断できることを運動機能評価できる方法を採用した。その結果,preliminaryではあるが脳保護作用を確認するのに時間を要し次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
トロンボモジュリンによる脳保護効果を前年度の研究成果から確認できた。また、虚血後のラットの運動機能評価および脳病変の解析で結紮後6時間後と24時間で、トロンボモジュリン投与群と非投与群で、運動機能障害、脳傷害の程度、脳浮腫の程度で有意な差を確認できた。したがって、平成27年度に計画していた①トロンボモジュリンの投与量、投与間隔、平成28年度②他の脳保護薬との併用、③脳病理組織の解析、④虚血再灌流実験を行うため準備を進めている。本計画遂行には動物倫理委員会の本年度承認を必要とする。そのため申請書類を作成している。また、本研究に必要なトロンボモジュリン薬はすでに準備が完了している。
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