細胞の運命決定にsignal intensityは重要か？

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461683
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 原田 和俊 東京医科大学, 医学部, 准教授 (20324197)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: hair follicle / skin tumor / signal transduction / Wnt / β-catenin

Outline of Annual Research Achievements

毛のう形成の分子メカニズムを解明することは、「毛髪」の再生を行う上で極めて重要である。さらに、近年増加傾向にある皮膚悪性腫瘍の中にも毛のう由来の腫瘍が数多く存在し、その治療法・予防法を確立する上で、毛のう形成シグナル伝達系の理解は必須である。本研究では発生・発癌において重要な役割を演ずるWntシグナル伝達系に注目し、毛嚢発生におけるWntシグナルの役割を解明するために、まずドキシサイクリン濃度依存的細胞内β-catenin発現システムの開発を試みた。
具体的には、Tet-onシステムを応用し、ドキシサイクリン濃度依存的にβ-catenin転写活性が上昇するプラスミドを構築するために表皮細胞特異的にトランス活性化因子を発現させるため、keratin 14 promoterの下流にこの因子をコードするプラスミドを作成した。また、当該実験のターゲット遺伝子はβ-cateninなので、TRE-Tightプラスミドの下流にβ-cateninのcDNAを結合したプラスミドを構築した。
上記の構築した2つのプラスミドをHaCaT細胞、SCC細胞株にトランスフェクションし、ネオマイシン、ハイグロマイシンなどの薬剤選択マーカーを用いて、stable transfectantを樹立を試みた。しかし、2つの異なるプラスミドを恒常的に十分量発現させることは、必ずしも容易ではないため、レトロウイルスベクターを用いることを検討している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ドキシサイクリン濃度依存的にβ-catenin転写活性が上昇するプラスミドとTRE-Tightプラスミドの下流にβ-cateninのcDNAを結合したプラスミドを恒常的に十分量発現させることが容易ではなく、当初とは別の方法で試みているため。

Strategy for Future Research Activity

2つの異なるプラスミドを恒常的に十分量発現させることを樹立させ、ドキシサイクリン濃度依存的細胞内β-catenin発現システムの開発を進めていく。また、β-catenin過剰発現表皮細胞株の表現型の解析を進める。

Causes of Carryover

研究計画が遅れているために、必要試薬を購入していないから

Expenditure Plan for Carryover Budget

培養液や試薬等の消耗品を購入予定