体内時計機能の脆弱化による気分障害発症と海馬ニューロン新生亢進機序の究明研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461709
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 栗田 征武 東北大学, 薬学研究科(研究院), 分野研究員 (10423790)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 守屋 孝洋 東北大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (80298207)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 時計遺伝子 / Clock / 気分障害 / 神経幹細胞 / 海馬ニューロン新生

Outline of Annual Research Achievements

古くより生体リズムの異常と気分障害には深い関係性があることが指摘されているが、体内時計の異常が気分障害発症の一因であるかどうかは証明されていない。ところで、時計遺伝子の一つであるclock 遺伝子の変異はマウスにおいて躁様症状を惹起することが報告された。一方、海馬ニューロン新生の異常は気分障害発症に深く関与することが知られているが、我々は神経幹細胞の細胞分裂が特定の時刻に好発することや、clock 変異マウスにおいて、神経幹細胞の増殖が亢進することを見出している。そこで本研究では、clock 変異マウスを用い、clock 遺伝子がどのような仕組みで神経幹細胞の細胞分裂を制御しているのかを明らかにし、神経幹細胞における体内時計の異常が気分障害の発症の一因になっている可能性を検討することを目的とした。
平成26年度の研究では、ClockΔ19 変異が海馬ニューロン新生に与える影響を個体レベルの解析によって検討した。その結果、野生型マウスではBrdU標識細胞数は海馬歯状回・顆粒細胞下層において明期開始11時間後をピークとする日内リズムを、また、有糸分裂期（M 期）マーカーのリン酸化ヒストンH3陽性細胞数は海馬歯状回・顆粒細胞下層において暗期開始11時間後をピークとする明瞭な日内リズムを示した。ClockΔ19 変異においては、BrdU標識細胞数およびリン酸化ヒストンH3陽性細胞数はいずれのサンプリング時間においても野生型マウスに比較して高かった。つまり、ClockΔ19 変異の影響は一日の時刻に関係なく、観察された。また、細胞死マーカーの活性化カスパーゼ3 レベルや、ニューロンやアストロサイトへの分化率に対してはClockΔ19 変異を与えなかった。本研究より、時計遺伝子Clockは海馬歯状回の神経幹細胞の細胞周期を一日の時刻非依存的に抑制的に制御していることが明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究開始前（平成25年度以前）に予備的な実験により、野生型マウスの海馬歯状回における神経幹細胞の増殖解析方法のノウハウを確立していたこと、およびその増殖のピークが１日の特定の時刻に観察されることを見出していたことが「研究の目的」を達成できた主な理由であると思われる。また、研究代表者および研究分担者の所属する実験動物飼養保管施設のキャパシティが高く、多数のClock変異マウスを飼育可能な環境が備わっていたことも要因の一つであると思われる。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度の研究により、個体レベルにおけるClock遺伝子の神経幹細胞の諸機能における役割が明らかになったため、平成27年度には当初の予定通り、培養神経幹細胞を用いた解析を実施する。
具体的には、ヘテロ変異マウス雌雄を一夜交配させ、妊娠15.5 日目の妊娠マウスより胎仔マウスを取り出す。１匹ずつ海馬神経幹細胞をフラスコに培養し、RT-PCR 法を用いたジェノタイピングを行い、+/+およびclock/clock の神経幹細胞を５日間培養する。各種plate に播種し、増殖因子で2 日間刺激し、その増殖の程度をWST-8 アッセイ、BrdU 取込みアッセイ、リン酸化ヒストンH3 免疫染色、PI-FACS 法で評価し、神経幹細胞自身のclock 変異が増殖亢進に寄与していることを確認する。すでに培養神経幹細胞においてEGF（20 ng/mL）による増殖にclock変異が亢進作用を示すことを確認しているので、増殖因子としてEGF を用いる。また２日間の増殖後に1% FCSで分化を誘導し、ニューロン・アストロサイト分化に与えるclock 変異の影響を検討する。Clock 変異による増殖亢進機序の一つとして、Clock タンパク質の認識配列であるE-box を有し、かつ細胞周期に抑制的に働くp21 やp27 など遺伝子発現が低下している可能性が考えられる。そこで、EGF 刺激後の神経幹細胞からRNA を抽出、逆転写後、PCR アレイ法によってclock 変異によって発現変化する遺伝子を網羅的に検索する。候補遺伝子の発現が培養条件下で概日リズムを示すのかをRT-qPCR法により確認し、clock下流の細胞周期因子を確定する。

Causes of Carryover

Clock変異マウスの効率的な繁殖に成功したため、実験動物の餌代・床敷代に余裕が生まれ、これにより当該助成金が発生した。また、研究着手前の予備実験により、免疫染色の至適条件をすでに確立できていたことも抗体などの染色試薬の節約につながり、これにより当該助成金が発生した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成26年度で観察されたclock 変異による神経幹細胞の細胞増殖亢進の分子機序を培養神経幹細胞を用いて明らかにする。野生型およびClock変異の神経幹細胞を分離培養し、増殖因子で刺激し、その増殖の程度をWST-8 アッセイ、BrdU 取込みアッセイ、リン酸化ヒストンH3 免疫染色、PI-FACS 法で評価する。Clock 変異による増殖亢進機序の一つとして、Clock タンパク質の認識配列であるE-box を有し、かつ細胞周期に抑制的に働くp21など遺伝子発現が低下している可能性が考えられる。そこで、EGF 刺激後の神経幹細胞からRNA を抽出、逆転写後、PCR アレイ法（細胞周期関連遺伝子）によってclock 変異によって発現変化する遺伝子を網羅的に検索する。候補遺伝子の発現が培養条件下で概日リズムを示すのかをRT-qPCR法により確認し、clock下流の細胞周期因子を確定する。

Research Products

• [Presentation] ROLE OF CLOCK GENE IN THE HIPPOCAMPAL NEUROGENESIS (2014)
  • Author(s): Jun Takoda, Shiori Sudo, Asuka Mogi, Hiromu Fukuzawa, Masatake Kurita, Tokiko Suzuki, Shigenobu Shibata, Takahiro Moriya
  • Organizer: The 2nd Taiwan-Tohoku univeristy Neuroscience Workshop for Young Scientists
  • Place of Presentation: 宮城県蔵王町
  • Year and Date: 2014-12-07 – 2014-12-10