2015 Fiscal Year Research-status Report
複合体ダイナミクスと機能プロテオミクスの融合による放射線感受性制御機構の解明
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26461880
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
榎本 敦 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (20323602)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DNA損傷シグナル / STK38 / DNA二重鎖切断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで研究代表者は、１）多くのヒト癌細胞株においてSerine-Threonine Kinase 38 (STK38)活性の亢進が認められること、２）STK38標的としたsiRNAによる発現抑制は、放射線増感を誘導すること、３）STK38がin vitroでp53やCDC25Aをリン酸化することなどを見出してきた。そこで本研究では、STK38をbaitとして、in vivoにおける生理的活性化複合体のプロテオーム解析を行い、DNA損傷シグナル伝達制御における新たな分子基盤の構築とSTK38を標的とした増感メカニズムの解明を目指し、独自の抗活性型STK38抗体およびSTK38の基質リン酸化を指標とした感受性予測法を確立することを目標としている。
これまでのプロテオーム解析の結果、生理的条件下においてSTK38と相互作用する分子として、新たにDNA二本鎖切断修復にかかわる因子を複数同定した。これらのSTK38相互作用分子は、In vitroにおいて、リコンビナントSTK38によってリン酸化されることも判明した。また一部の基質においては、質量分析法によるリン酸化部位の同定にも成功した。現在、これらの新しい基質においてリン酸化部位変異体発現ベクターを作成し、安定的にリン酸化部位変異体を発現する体細胞変異株を樹立中である。今後は、野生型発現株とリン酸化部位変異体発現細胞における放射線感受性、DNA二重鎖切断修復能、アポトーシス誘導能などを比較し、STK38の生理的な意義を明らかにする。さらにリン酸化部位を同定できた基質タンパク質については、部位特異的抗体抗体を作成し、感受性指標としての有用性を検討を行う。
また研究代表者は、本課題に関係する放射線感受性のメカニズムに関して、一般人向けのDVD教材の編集にも携わった（日本アイソトープ協会「Effects of Radiation on Human body」M. Izumi, A. Enomoto, N. Sugiura, H. Tauchi, Y. Matsumoto, B. Y. Hales, K. Shiotsuki, T. Shibata.(2015))。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで研究代表者は、in vivoにおける生理的活性化複合体のプロテオーム解析を行い、STK38と相互作用する分子として、新たにDNA二本鎖切断修復にかかわる因子を複数同定した。これらのSTK38相互作用分子は、in vitroにおいて、リコンビナントSTK38によってリン酸化されることも判明した。また一部の基質においては、質量分析法によるリン酸化部位の絞り込みも行い、さらにリン酸化の候補部位をアラニンに置換した変異体においてSTK38によるリン酸化が起こらないことを確認し、基質のリン酸化部位を確定した。現在、これらの新しい基質において安定的にリン酸化部位変異体（アラニン置換体）を発現する体細胞変異株を樹立中である。しかしながら、野生型に比べてリン酸化部位変異体の安定株取得は、予想に比べて困難な面があり、今後は温度や薬剤による発現誘導システムを取り入れることも視野に入れている。一方、ヒトHEK293T細胞にリン酸化部位変異体を一過性発現したところ、タンパク質の発現量および安定性に関しては特に野生型と比較して相違はないことを確認している。
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| Strategy for Future Research Activity |
プロテオーム解析により同定したSTK38相互作用タンパク質の中で、STK38によってリン酸化されるものに関しては、リン酸化部位を同定したのち、リン酸化部位変異体の樹立およびリン酸化部位特異的抗体の作成を進めている。これらのうち、STK38のDNA損傷における活性化および基質のリン酸化の意義を明らかにするため、野生型発現株とリン酸化部位変異体発現細胞における放射線感受性、DNA二重鎖切断修復能、アポトーシス誘導能などを比較検討する。さらにリン酸化部位特異的抗体を作成し、DNA修復遺伝子のノックアウト細胞を含む様々な放射線感受性株におけるリン酸化パターンを比較し、感受性あるいはDNA修復能との相関について解析を行い、感受性指標として有用性を検討する。さらに放射線感受性だけはなく、癌マーカー（浸潤、転移、悪性度等）とのリン酸化パターンの相関について解析を行い、予後マーカーとしての有用性についても検討する。
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| Causes of Carryover |
実験方法の改良により、当初の計画よりも、条件検討に費やす時間・試薬代等を節約することができた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度への繰り越し金は、本研究最終年度にあたるため、論文発表等の成果公表に向けた準備に充てる予定である。
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