2014 Fiscal Year Research-status Report
過冷却プログラム凍結したヒト肝幹細胞を利用した再生外科治療の橋渡し的基礎研究
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26461921
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
水口 徹 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (30347174)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
谷水 直樹 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (00333386)
平田 公一 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50136959)
三高 俊広 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50231618)
石井 雅之 札幌医科大学, 医学部, 研究員 (50643201)
市戸 義久 札幌医科大学, 医学部, 研究員 (80452978)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 肝細胞移植 / 肝不全 / 腹腔鏡下肝切除 / 肝細胞癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト肝細胞の分離に関しては順調に進んでおり、ドナー細胞採取に係る安全性の検討や手技の報告を行った。外側区域切除によるドナー採取は、安全性と効率性を重視するが、手技の報告を行った（Mizuguchi T, et al. J Liver 2:141.）。また、術中の乳酸はドナー細胞の生存率に影響し、温阻血時間によって術後の感染性合併症を惹起するため、測定モニタリングの有用性に関して報告した（Meguro M, Mizuguchi T, et al. J Hepatobiliary Pancreat Sci. 2014;21:489-498.）。また、この合併症に関して一定の学術的評価を行うため、分類と程度に関して基準を作成した（Ishii M, Mizuguchi T, et al. World J Hepatol. 2014;6:745-751.）。また、ドナー採取におけるハーベスト方法に関しても、解剖学的領域を意識した切離方法と意識しない方法とでは、ドナー手術のリスクが異なるほか、切除適応になった病態の長期予後も影響を与えうる可能性を指摘した（Ishii S, Mizuguchi T, et al. World J Gastroenterol. 2014;20:3335-3342.）。次に、最大量のドナー細胞採取は、肝右葉切除において期待されるが、手技そのものに危険性が伴う。これを安全に施行する為、肝臓の背面で下大静脈前面に生理食塩水を注入して行う方法を考案し、手技のビデオも併せて報告した（Mizuguchi T, et al. J Am Col Surg 2014;219:e11-4.）。また、細胞の栄養バランスとしてBCAAの重要性に関して臨床的意義を報告してきたが、これまでの報告をまとめて、著書として出版した（Mizuguchi T, Mitaka T, Hirata K. In Rajendram R, Preedy VR, Patel VB, eds. The branched chain amino acids in health and disease. London: Springer; 2015. pp65-77）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ドナー細胞の確保は、合併症を作らず、安定して採取できている。動物実験・遺伝子組み換え動物の使用許可で時間を取られている以外は、ほぼ順調を考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度以降の研究計画
細胞障害評価：過冷却保存細胞は37℃の温浴槽にて急速加熱を行い、細胞遠心後の凍結液上清中のAST/ALTおよびLDHを測定する。細胞の一部は蛍光標識によるDead/Alive cell検出キット (Molecular Probe) により二重標識を行い、顕微鏡下でシグナルを解析し生存率を決定する。コントロールにTrypan Blueによる評価も行う。また、解凍後に生理食塩水で洗浄し、30分の氷上整置後の細胞にも同様の解析を行う。逸脱酵素の測定と細胞状態の形態学的検討により、もっとも良い条件の凍結保存方法が開発できる。最終的にはApoptosis検出キット(Molecular Probe)および細胞内ATPの測定と走査電顕による形態観察を追加する予定である。
凍結・解凍ヒト小型肝細胞培養実験：一部の細胞はわれわれの開発したヒト肝細胞培養を行う。凍結ヒト小型肝細胞を解凍し培養・薬物代謝酵素の誘導・確認試験を行う。培養後1日目に生着率および生存率（細胞障害評価を参照）を検討し、リファンピシンによるCytochrome P450 Cyp 3Aの誘導実験を行い、RT-PCR法およびWestern blot法により酵素誘導能を確認する。また、BrdUラベルによる免疫染色により細胞増殖能を評価し、in vitro標準培養ヒト肝細胞の適正を検討する。
ヒト化肝臓ハイブリットマウスの作製：マウスにはIL-2Rγnull (NOG)マウスを使用する。肝臓には放射線を照射し、48時間後に脾臓内過冷却保存ヒト肝細胞移植（5 X 105 cell/animal）および新鮮ヒト肝細胞移植（5 X 105 cell/animal）を行う。前回までの検討では、放射線照射を検討項目としていたが、重度免疫不全モデルでは持続する肝炎が観察されることから必ずしもこれを必要としない。そこで、複数の同様モデルの再生置換率を1ヶ月、3ヵ月とし最長で6ヶ月の観察を行い比較検討する。脾内肝細胞移植では脾臓下極より27G針によりマイクロ顕微鏡下に移植を施行予定。
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| Causes of Carryover |
動物実験委員会による審査の結果、遺伝子組み換え動物実験の申請・許可が条件となり、この申請手続きに時間を要し、当初に予定していた動物購入ができなかったため、次年度にその分を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
IL-2Rγnull (NOG)マウスの購入を行う予定。
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[Journal Article] Soluble Lutheran/basal cell adhesion molecule is detectable in plasma of hepatocellular carcinoma patients and modulates cellular interaction with laminin-511 in vitro.2014
Author(s)
Kikkawa Y, Miwa T, Tanimizu N, Kadoya Y, Ogawa T, Katagiri F, Hozumi K, Nomizu M, Mizuguchi T, Hirata K, Mitaka T.
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Journal Title
Exp Cell Res.
Volume: 328
Pages: 197-206
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Clinical comparison of laparoscopic and open liver resection after propensity matching selection.2015
Author(s)
Meguro M, Mizuguchi T, Kawamoto K, S. Ota, M. Ishii, Nishidate T, Okita K, Kimura Y, Hirata K.
Organizer
10th Annual Academic Surgical Congress, Quick shot oral presentation
Place of Presentation
Las Vegas, NV, USA
Year and Date
2015-02-03 – 2015-02-05
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[Presentation] Vitamin A-Binding Liposome Containing Heat Shock Protein 47 siRNA Regulates Pancreatic Regeneration.2014
Author(s)
Ota S, Mizuguchi T, Nishimura M, Ishi1 M, Okita K, Nishidate T, Nobuoka1 T, Kimura Y, Niitsu Y, Hirata K.
Organizer
45th Anniversary Meeting of American Pancreatic Association and Japan Pancreas Society
Place of Presentation
Big Island, Hawaii, USA
Year and Date
2014-11-05 – 2014-11-08
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[Presentation] A novel technique of aqua-hanging maneuver method for large right liver tumors.2014
Author(s)
Mizuguchi T, Hirata K, Meguo M, Ishii M, Okita K, Nishidate T, Ueki T, Ota S, Nobuoka T, Kimura Y, Kawamoto M.
Organizer
The Scientific Meeting of the Japan-Hungary-Poland Surgical Society Triangle Sympoisium 2014
Place of Presentation
Tokyo, Japan
Year and Date
2014-10-17 – 2014-10-19
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