Functional analysis of tumor suppressor gene BAP1, NPM1 complex

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26461962
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 西川 裕之 聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 研究技術員 (90387077)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 脱ユビキチン化 / DNA修復

Outline of Annual Research Achievements

実験実施計画にしたがって、2017年度に引き続き免疫沈降-液体クロマトグラフィ-タンデムマススペクトロメトリー (IP-LC-MS/MS)法を用いて実験を行った。この方法は培養細胞に目的遺伝子（BAP1,NPM1）を導入してタンパク質を発現させる。DNA損傷をおこさせた後に細胞を溶解しBAP1,NPM1コンプレックスに結合するタンパク質を免疫沈降し直接プロテアーゼ処理して複合体の混合ペプチドを作成した。作成したペプチドをLC-MS/MSにて分析し質量データを得た。この混合ペプチドの質量データをMATRIX Science社のMASCOT及びX!Tandemの２つのプログラムを用いてデータベース検索し結合タンパクの同定を試みた。混合ペプチドを用いているため検索結果に非特異的な結合タンパク質が混ざるので結果閲覧プログラム、MATRIX Science社のSCAFFOLDにて特異的、非特異的なタンパク質の結合を検討した。タンパク質同士の結合を保ちながら核及びクロマチンタンパク質を可溶化する為に細胞溶解には150ｍM以下の塩濃度に調製した溶解液に低温下で機能するエンドヌクレアーゼ(ベンゾナーゼ)を用いて実験を行った。
複数の結合タンパク質から細胞内での機能を解析する為に結合タンパク質の増減を元にIPAソフトウエアを用いてパスウェイ解析を行った。複数のパスウェイに影響がある事が示唆された。
BAP1及びNPM1の機能として質量分析から結合タンパク質とそれらに関与する機能としてパスウェイ解析から予想された転写因子調節、セルサイクル（チェックポイント）、クロマチン修飾、二本鎖DNA損傷修復にどのように影響を与えるか検討した。