次世代シーケンサーを用いた胃癌・GIST患者末梢血中腫瘍由来浮遊DNAの検出

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461977
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 黒川 幸典 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10470197)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ctDNA / 次世代シーケンサー / 胃癌 / GIST

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、胃癌患者およびGIST患者の末梢血を用いて次世代シーケンサーによる腫瘍由来遊離DNA (ctDNA)の検出を行い、早期発見法や再発診断法あるいは抗癌剤の効果判定法などの確立につなげることを目的とする。
平成26年度は、当院で診療を行った胃癌患者およびGIST患者を対象に、組織の収集とDNAの抽出を行った。治療開始前の検体として、上部消化管内視鏡検査の際に生検組織を5例採取し凍結保存した。これとは別に、手術患者30例の切除標本から腫瘍組織と正常組織を採取し、ただちに凍結保存した。これらの組織のうち、今後研究対象となる可能性のある患者19例の組織からDNAを抽出した。
特にイマチニブ耐性病変を持つGIST患者5例において、イマチニブに感受性を持つとされるCKITのexon11内の遺伝子変異と、イマチニブ耐性の原因であるとされるCKITのexon13、14、17、18内の遺伝子変異を検出する目的で、それらのexonの全coding領域を網羅するようなプライマーを作成し、初発病変およびイマチニブ耐性病変の腫瘍組織を用いてサンガーシーケンス法にて変異部位を検索した。初発病変については5例全てでexon11内に変異を認めたほか、イマチニブ耐性病変については5例中4例でexon13内に変異を認め、残りの1例でexon18の変異を認めた。この5例からは耐性病変の治療前後で血漿を採取しDNAを抽出した上で、腫瘍特異的なexon11、13、18の変異を血漿から検出するためのプライマーを新たに設計し、血漿DNAのシーケンシングを行い、血漿DNAにおけるctDNAの存在比率を算出した。各サンプルにおいて0.008-9.385%の割合でctDNAを認め、5例中3例で治療後にctDNAの割合が低下していた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成26年度の計画としては、組織の収集とDNAの抽出および原発巣のシーケンシングとその結果の解析を予定としていた。現在までに、胃癌およびGISTともに組織を収集し、今後シーケンシングの対象となる可能性のある患者の組織からはDNAを抽出することができた。またイマチニブ耐性GIST患者5例に関しては上記以外に、原発巣のシーケンシングを行い腫瘍特異的な変異を同定した。さらに耐性病変の治療前後での血漿を採取してDNAを抽出し、腫瘍で同定した変異を血漿から検出するためのプライマーを新たに設計し、血漿DNAのシーケンシングを行い、血漿DNA中におけるctDNAの比率を算出することができた。以上より、GIST症例に関しては平成26年度の計画は達成しており、研究全体としてはおおむね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

イマチニブ耐性GIST患者5例から白血球ゲノムDNAを抽出し、血漿DNAにおける変異解析と同様の手法を用いてシーケンシングを行い、腫瘍に特異的な変異をgermline mutationとして認めないことを確認する。また、本研究で用いる変異検索法において、健常人では患者の腫瘍に特異的な変異を検出しないことを確認する目的で、健常人から白血球ゲノムDNAを抽出し、血漿DNAにおける変異解析と同様の手法を用いてシーケンシングを行い、腫瘍に特異的な変異の割合を検索し、ctDNAの検出感度を求める。今回行った手法により、GISTに特異的な遺伝子変異を血漿DNAから検出できることが分かれば、関連病院を含めて多施設共同臨床研究を計画し、治療効果予測や薬剤選択において有用であるかどうかを検証する。
胃癌患者に対しても次世代シーケンサー用試薬であるCancer Panelを用いて胃癌原発巣における腫瘍特異的な変異を同定する。GIST患者に対して行ったものと同様の手法で血漿DNAを用いてシーケンシングを行いctDNAの割合を算出し、腫瘍ボリューム、臨床病期、転移臓器などとの関連性について解析する。手術前後のサンプルについては、術後のctDNAの消失の有無と再発の関連性について検討する。

Causes of Carryover

腫瘍に特異的な変異をgermline mutationとして認めないことを確認するためのシーケンシングに必要な物品を購入し終えたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

血漿DNAにおける変異解析と同様の手法を用いてシーケンシングを行い、腫瘍に特異的な変異の割合を検索し、ctDNAの検出感度を求めるのに必要な物品を購入するため。