2014 Fiscal Year Research-status Report
microRNAを介した胃癌における抗HER2抗体耐性機序の解明
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26461982
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
林 尚子 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (20452899)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石本 崇胤 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (00594889)
馬場 祥史 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 講師 (20599708)
岩槻 政晃 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (50452777)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | miR-21 / PTEN / Trastuzumab |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HER2陽性胃癌株化細胞のうち、トラスツズマブ感受性株であるNCI-N87を同定し、同株にトラスツズマブの持続投与を６か月間行った。親株と持続投与を行った株で、トラスツズマブを用いてGrowth assayを行うと、耐性が形成され、トラスツズマブ耐性株が作成された。トラスツズマブ耐性株と親株でmicroRNA microarrayを用いて耐性に関与するmicroRNAの網羅的に解析を行った。miRTarBase、TargetScanを用いてin silicoでPTENを標的とし得るmiR 21-5pを同定した。NCI-N87を用いluciferase assayを行い、miR21-PTENが直接bindingすることを確認した。胃癌細胞株においてHER2陽性で、miR-21発現低下し、PTEN発現が上昇しているNCI-N87とmiR-21が発現上昇し、PTEN発現が低下しているNUGC4の2種類の細胞株を用いて以下の実験を進めた。NCI-N87へmiR-21の強制発現(mimic)をおこなったところPTEN発現が低下し、AKTのリン酸化が上昇した。逆に、NUGC4にmiR-21の発現抑制 (inhibitor)をおこなったところPTEN発現が上昇し、AKTのリン酸化が低下した。同様にmiR -21をNCI-N87へmiR-21の強制発現を行い、トラスツズマブを用いてGrowth assayを行ったところ、元来トラスツズマブに感受性を示していた細胞株が、感受性が低下した。逆に、NUGC4にmiR-21の発現抑制を行い、トラスツズマブを用いてGrowth assayを行ったところ、トラスツズマブに対して感受性が上昇した。トラスツズマブ耐性におけるメカニズムとして、PTEN 発現低下による抗アポトーシスを考え、NCI-N87にmiR-21強制発現を行い、フローサイトメトリーによるアネキシンアッセイを行ったところ、有意にトラスツズマブ投与によって誘導されるアポトーシスする細胞の割合が低下した。さらに、PARP・Caspase-3といったアポトーシス関連タンパクの発現もウエスタンブロット法にてその発現が低下することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
胃癌は血行性転移やリンパ行性転移のみならず、治療法の確立されていない腹膜播腫をきたしやすく、死亡率の高い癌腫である。近年、HER2 陽性胃癌に対して分子標的治療薬であるトラスツズマブの有効性が示され、治療成績の向上が期待されるが、他の抗腫瘍薬と同様にその耐性が懸念されるところである。本研究は遺伝子発現調節機構として注目されているmicroRNA に着目し、microRNA-gene pathway からHER2 陽性胃癌に対する抗HER2 抗体薬耐性機構を明らかにすることを目的として、下記のことを達成した。
・HER2 陽性胃癌株化細胞のうち、トラスツズマブ感受性株であるNCI-N87を同定し、同株にトラスツズマブの持続投与にてトラスツズマブ耐性株を作製した。
・トラスツズマブ耐性株と親株でmicroRNA microarray を用いて耐性に関与するmicroRNA の網羅的に解析を行った。さらに、in silicoにてPTEN を標的とし得るmiR 21-5pを同定した。
NCI-N87を用いluciferase assay を行い、miR21-PTENが直接bindingすることを確認した。miR-21の強制発現にて下流シグナルの変化とトラスツズマブ感受性が低下することと、発現抑制によっても下流シグナルが変化しトラスツズマブ感受性が上昇することをそれぞれ胃癌細胞株において確認した。トラスツズマブ耐性におけるメカニズムとして、抗アポトーシスが一因であることを確認した。
以上の結果を、国内・国外の学会を通じて発表を行い、またAnnals of Surgical Oncologyに報告し、日本国内だけなく、国外に向けても発信した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今までの検討はin vitroの結果のみであり、今後は臨床検体を用いて、in vitroの整合性を確認していきたい。臨床検体においてトラスツズマブ耐性症例と奏効症例の原発巣生検組織と血清を集積し、各検体でHER2,PTEN,miR-21の発現を免疫染色やreal time PCR法を用いて評価し、各因子の相関関係を評価する。また、in vitroと同様にトラスツズマブ耐性症例と奏効症例の原発巣生検組織と血清を用いて、miR microarray を行い、トラスツズマブ耐性に関与するmicroRNA を同定し、in vitroでおこなったarrayと比較検討を行う。上記の結果をもとに集積したサンプルを用いて、生検組織でのmiR、PTEN 発現や血清中のmiR の発現を多数での症例でvalidation を行い、本研究の臨床的な妥当性を検証する。さらにPTEN 発現抑制メカニズムの網羅的解析として、胃癌においてPTEN の発現低下がmicroRNA によるものであれば、同定されたmicroRNA が存在する染色体のcopy number を確認し、genome レベルでのpathway を確認する。PTEN 発現低下がmicroRNA に依存していない場合は、genome copy number loss 、p53 mutation status や プロモーター領域のhypermethylation を確認し、胃癌におけるPTEN の発現低下のメカニズムを網羅的に解析する。
Arrayにて同定されたその他のmiRに関しても、同様の実験を行い新規miR, gene のトラスツズマブ耐性マーカーの有用性を確立したい。その他抗HER2 抗体薬における耐性の検証も行いたい。近年、ラパチニブ、ペルツズマブ、T-DM1など抗HER2抗体薬の有用性が報告されており、これらの薬剤を用いて同様の実験を行い、これらの耐性についても検討を進める。
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| Causes of Carryover |
当初想定より比較的安価での試薬購入が可能であったため。また、医局内保管の共用試薬・消耗品の利用が可能であったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究費の大部分は実験試薬及び消耗品の購入、研究成果発表のための学会出張旅費に充てる予定である。
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[Journal Article] The microRNA-21/PTEN pathway regulates the sensitivity of HER2-positive gastric cancer cells to trastuzumab2014
Author(s)
Eto K, Iwatsuki M, Watanabe M, Ida S, Ishimoto T, Iwagami S, Baba Y, Sakamoto Y, Miyamoto Y, Yoshida N, Baba H
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Journal Title
Ann Surg Oncol
Volume: 21(1)
Pages: 343-50
DOI
Peer Reviewed
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