2015 Fiscal Year Research-status Report
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26462028
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
川上 和之 東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (00293358)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | LINE-1 / レトロポゾン / 大腸癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マイクロアレーを用いた昨年度の研究で示唆されたLINE-1ノックダウンによるmicro RNAの発現変化を、real-time RT-PCRおよびNorthern blottingで確認した。real-time RT-PCRおよびNorthern blotting いずれの解析法でも２倍以上の発現増加や減少を認め、かつLINE-1を高発現する大腸がん培養細胞、SW480とCaco2で共通した変化として3配列のmicro RNAが候補として選択された。このうちLINE-1ノックダウンにより発現増加を認めた2配列のmicro RNAを化学合成し、SW480とCaco2へトランスフェクション処理した。micro RNAのトランスフェクションによる細胞増殖の変化をMTT assayで解析したが、がん細胞の増殖能に変化を認めなかった。残り1配列のmicro RNAはLINE-1ノックダウンにより発現低下を認めたため、当該micro RNAに対するsiRNAを合成しノックダウンによる変化を解析した。その結果、当該micro RNAのノックダウンによりSW480とCaco2のいずれも増殖が抑制された。これらの結果から、当該micro RNAがLINE-1によるがん細胞の増殖に直接関与することが示唆された。
APOBECの発現性がLINE-1の機能に関与しているのかを確認する目的で、LINE-1高発現細胞であるSW480、Caco2とLINE-1低発現細胞であるHCT116、CaR-1でのAPOBEC発現性を解析した。APOBEC1, 2, 3A, 3B, 3C, 3F, 3G, 3H mRNAの発現性をreal-time RT-PCRで解析したが、LINE-1高発現と低発現細胞間でAPOBECの発現性に相違は認められなかった。この結果から、APOBEC蛋白の機能抑制を介した癌治療戦略に関しては短期間での成果は期待できないと判断しこれ以上の解析は中止した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
複数のAPOBEC mRNAの発現性を解析したがLINE-1高発現と低発現細胞間でAPOBECの発現性に相違は認められず、蛋白の機能抑制を介した癌治療戦略に関しては短期間での成果は期待できないと判断し解析を中止した。一方、real-time RT-PCRおよびNorthern blotting の解析により、LINE-1によるがん細胞の増殖に関与する可能性があるmicro RNAを3候補選択することができた。特にLINE-1ノックダウンにより発現低下を認めた1配列のmicro RNAはLINE-1によるがん細胞の増殖に直接関与することが示唆され、今後の研究展開の見通しを含めて順調と判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
LINE-1によるがん細胞の増殖に直接関与することが示唆されたmicro RNAの機能に関してさらに解析を進める。あらかじめ当該micro RNAをノックダウンした場合にLINE-1の抑制によりがん細胞の増殖性に変化があるのかを解析する。また、LINE-1の配列をクローン化しLINE-1低発現細胞であるHCT116、CaR-1細胞内で強制発現させる。この処理によりmicro RNAの発現性に変化を認めるのかを確認する。さらにLINE-1の強制発現細胞を用いてLINE-1発現とmicroRNA発現間の相関性やその制御メカニズムを解析する。非核酸アナログ系の逆転写阻害剤を使用したLINE-1の逆転写酵素阻害とその細胞増殖活性に与える影響の解析を継続し逆転写酵素阻害剤の抗がん剤としての使用可能性を探索する。
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| Causes of Carryover |
APOBEC蛋白の機能抑制を介した癌治療戦略に関しては短期間での成果は期待できないと判断ため、当初計画していた同機能抑制による治療開発は着手しなかった。そのため当初予算の一部を使用せず、次年度の使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度ではLINE-1によるがん細胞の増殖に直接関与することが示唆されたmicro RNAの機能解析とLINE-1の逆転写酵素阻害による治療開発を優先的に進展させる。特にLINE-1の癌増殖亢進活性と関与するmicro RNAの機能解明により新たな治療戦略の構築を目指す。
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