2014 Fiscal Year Research-status Report
肝血流低下による肝萎縮機構の解明とLSKLpeptideを用いた新規治療法の開発
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26462046
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
生田 義明 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (70452894)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
近本 亮 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (10419640)
馬場 秀夫 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 教授 (20240905)
林 洋光 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 助教 (80625773)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 門脈血流低下 / 肝萎縮 / TSP-1 / Smad2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
門脈血流低下による肝萎縮において障害を受けた肝類洞内皮細胞からTSP-1分泌が誘導され、TGF-β-Smadシグナルを活性化することで肝萎縮が誘導されていると予想される。野生型マウス（C57BL/6J）を用いて左右門脈のうち右門脈を結紮して部分的な肝萎縮を誘導した。門脈の結紮を行った肝右葉を結紮肝、結紮を行わなかった肝左葉を非結紮肝とした。門脈結紮したマウスは術後6時間、24時間、48時間後にsacrificeし、結紮肝および非結紮肝を摘出した。各タイミングで５匹の門脈結紮マウスを作成した。
摘出した肝臓は緩衝ホルマリン液に固定し、ヘマトキシリン・エオジン染色、抗PCNA抗体による免疫染色、TUNEL染色を行った。
結紮肝（萎縮肝）では術後６時間以降に類洞の拡張を認め、48時間以降で肝細胞核におけるヘマトキシリンの染色性が低下した。また、PCNAの発現は結紮後６時間をピークに上昇し、その後発現は低下した。TUNEL染色は術後６時間後核の染色が増加した。一方、非結紮肝（肥大肝）では術後６時間以降、PCNAの発現が上昇した。TUNEL染色では核の染色は認めなかった。
抗TSP-1抗体および抗pSmad2抗体による免疫染色にて結紮肝では術後６時間以降、肝細胞細胞質でのTSP-1の発現は上昇し、核でのpSmad2の発現も上昇した。非結紮肝では肝細胞細胞質内でのTSP-1の発現、核でのpSmad2の発現を認めなかった。
すなわち、門脈血流の低下は肝細胞におけるTSP-1の発現上昇を促し、TGF-β/Smad2シグナルを介して肝細胞の増殖抑制とアポトーシスが誘導されていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マウスの門脈の結紮にはヒトに対する血管結紮用のクリップ（small SLS™ clip）を用いた。マウスの門脈は微細であり、さらに微細な肝動脈の結紮を伴うことなく、結紮肝の壊死を来さないような正確な右門脈結紮手技を確立するのに時間を要した。また、門脈結紮手技が確立するまで、一定の実験結果が得られなかったことも実験計画の遅れの原因となった。
右門膜結紮により得られた結紮肝（萎縮肝）、非結紮肝（肥大肝）について、PCNAの免疫染色、TUNEL染色を行い、術後の肝細胞再生および肝細胞アポトーシスについて時系列的変化を明らかにした。すなわち、結紮肝（萎縮肝）では肝細胞の増殖能の低下とアポトーシスの亢進、非結紮肝（肥大肝）では細胞増殖能の亢進とアポトーシスの抑制が確認された。さらにTSP-1およびpSmad2の免疫染色によって、TSP-1の発現上昇とその下流のSmad2のリン酸化が結紮肝（萎縮肝）で認められ、門脈血流低下によるTSP-1が肝細胞再生の抑制とアポトーシス亢進による肝萎縮のメカニズムに関与していることを確認した。非結紮肝では逆にTSP-1の発現は低下し、肝細胞再生の促進とアポトーシス抑制が見られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今までの研究にて門脈の結紮により肝細胞におけるTSP-1誘導を介して、細胞増殖が抑制され、アポトーシスが誘導されていることを示した。ヒトでも同様の機序が門脈血流低下で作用していることを示す必要がある。肝腫瘍の切除術においては、術前に腫瘍を有する肝葉の門脈を塞栓させることで切除予定肝を萎縮させ、残肝を肥大させるPVE（portal vein embolization）が行われる。当科ではPVE後の肝切除を行ったパラフィン包埋標本を有し、今回のマウスモデルで確認したTSP-1による機序を明らかにできると考えられる。また、PVE後の肝腫瘍切除の際に採取した背景肝の凍結組織を当科は保有しており、Western blottingによるタンパク発現の解析、real time PCR法を用いたmRNAの解析を行う。また、cDNA microarrayを用いて門脈結紮による肝血流低下によるTSP-1に加え、その他の遺伝子の発現について検討する。
また、TSP-1 inhibitory peptideであるLSKL peptideを門脈結紮モデルマウスに投与することで、門脈血流低下によるTSP-1を介した肝萎縮機構についてのメカニズムをさらに明らかに出来ると考えられる。
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| Causes of Carryover |
試薬等の消耗品について、当初の想定より安価で購入ができ、また、医局内保管の試薬を使用することができたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
動物実験を中心に進めていくため、実験動物（マウス）の購入費及び維持費、動物実験に係る試薬・消耗品の購入に充てる予定である。
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Research Products
(4 results)
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[Journal Article] The modified Glasgow Prognostic Score (mGPS) is a good predictor of indication for palliative bypass surgery in patients with unresectable pancreatic and biliary cancers2014
Author(s)
Ikuta Y, Takamori H, Sakamoto Y, Hashimoto D, Chikamoto A, Kuroki H, Sakata K, Sakamoto K, Hayashi H, Imai K, Nitta H, Hirota M, Kanemitsu K, Beppu T, Baba H
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Journal Title
Int J Clin Oncol
Volume: 19(4)
Pages: 629-33
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Neuroendocrine tumor in the Glissonean pedicle of the hepatic hilum2014
Author(s)
Kaida T, Chikamoto A, Kiyozumi Y, Nitta H, Imai K, Nakahara O, Ikuta Y, Doi K, Ishiko T, Takamori H, Beppu T, Baba H
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Journal Title
Int Canc Conf J
Volume: 3(2)
Pages: 72-6
DOI
Peer Reviewed
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