2014 Fiscal Year Research-status Report

キマーゼ阻害薬・MMP阻害薬を用いた肝類洞閉塞症候の予防および治療効果の検討

Research Project

Project/Area Number	26462049
Research Institution	Osaka Medical College
Principal Investigator	米田浩二大阪医科大学, 医学部, 非常勤講師 (70531896)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	高井真司大阪医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80288703)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	キマーゼ / 肝類洞閉塞症候 / マトリックスメタロプロテアーゼ / モノクロタリン / 酸化ストレス / 肝細胞壊死 / 肥満細胞 / TNF-α
Outline of Annual Research Achievements	肝類洞閉塞症候のモデルを作製するためマウスにモノクロタリンの200mg/kgを腹腔内に投与した。モノクロタリン投与後の血液および肝臓組織を継時的に解析し肝類洞閉塞症候モデルがマウスで確立できることを確認した。モノクロタリン投与後48時間の時点より約20％のマウスが死亡し120時間の時点では約70％が死亡していた。そのためモノクロタリン投与後48時間と120時間の時点における解析は生存していたマウスで行った。血液中のAST活性とALT活性を測定した結果48時間では共に著明に増加したが120時間後には低下していた。血液中のアルブミンはモノクロタリン投与後48時間において有意に減少したが120時間後には正常化していた。総ビリルビンはモノクロタリン投与後48時間において有意に増加したが120時間後には低下していた。臓組織抽出液中のキマーゼ活性およびキマーゼにより活性化されるマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）-9活性はモノクロタリン投与後48時間の時点で有意に高値を示した。肝臓組織抽出液中のキマーゼ活性、キマーゼ関連因子のMMP-9活性はモノクロタリン投与後48時間の時点で著明に増加した。肝臓組織抽出液中のTumor necrosis factor (TNF)-αレベルもモノクロタリン投与後48時間の時点で著明に増加した。また肝臓組織中のキマーゼ、MMP-9、TNF-αの遺伝子発現をRT-PCRにて定量した結果モノクロタリン投与後48時間の時点でこれらすべての遺伝子発現が有意に増加していた。肝臓組織切片の解析においてもモノクロタリン投与後48時間の時点で明確な肝細胞の壊死と肥満細胞の集積を認めた。これらの結果よりモノクロタリンを200 mg/kgを腹腔内投与することにより、肝類洞閉塞症候モデルが形成されることが確認できた。またキマーゼに関連する因子であるMMP-9活性およびMMP-9の遺伝子発現がキマーゼと関連してモノクロタリン投与後増加し、炎症誘発因子であるTNF-αも増加してくることが判明した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 今年度は肝類洞閉塞症候のモデルをマウスで作製し、肝類洞閉塞症候モデル作製後のキマーゼおよびMMP阻害薬による影響を解析することを目標とした。マウスを用いた肝類洞閉塞症候モデルの作製には、モノクロタリンの200 mg/kgを腹腔内に投与して作製した。本モデルでは、モノクロタリンを投与したのち48時間の時点より血液中のAST活性が共に著明に増加することを確認できた。このAST活性とALT活性はラット用の試薬にて解析することが可能であった。血液中の炎症マーカーのTNF-αは、市販のマウスTNF-α測定用のELISAキットにて測定し、モノクロタリンを投与した48時間後に著明に増加することを確認できた。肝臓組織抽出液を用いてキマーゼ活性の測定方法は、基質にSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCAを用いることで定量でき、モノクロタリンを投与した48時間後より有意に増加してくることが確認できた。また、肝臓組織中のキマーゼ関連因子であるMMP-9活性は、市販のマウス用のMMP-9活性測定キットにて測定することが確認でき、キマーゼ活性同様にモノクロタリンを投与した48時間後より有意に増加してくることが確認できた。肝臓組織切片の解析には肝細胞壊死をHE染色にて解析し、キマーゼの発現細胞である肥満細胞はアザン染色にて行った。その結果、モノクロタリンを投与した48時間の時点で明確な肝細胞壊死と肥満細胞の集積を確認できた。今年度の目標であった肝類洞閉塞症候モデルにおける経時的な血液中のAST，AST，アルブミンおよび総ビリルビンの動態解析を行うと共にキマーゼおよびキマーゼ関連因子、そして、炎症関連因子のTNF-αの解析、組織解析ができた。その一方で、キマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬による影響も解析する予定であったが、その解析を次年度以降に行うことになった。
Strategy for Future Research Activity	今年度にマウスの肝類洞閉塞症候モデルを用いてキマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬用いて類洞閉塞症候におけるこれら薬物の影響を明確にする予定である。キマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬による影響は、予防効果で評価する予定である。方法は、モノクロタリンを投与する前よりキマーゼ阻害薬またはMMP阻害薬を投与し、これらの阻害薬投与による影響を解析する。解析項目は、血液中の解析項目として、モノクロタリン投与後24、48、120時間の時点で採血する。AST活性とALT活性を測定し、TNF-αは市販のヒトELISAキットにて測定する。そして、各点におけるキマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬とプラセボを比較検討する。肝臓組織抽出液を用いて、モノクロタリン投与後24、48、120時間のキマーゼ活性およびMMP-9活性を測定し、各点におけるキマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬とプラセボを比較検討する。。肝臓組織中のTNF-αも同様にモノクロタリン投与後24、48、120時間で測定し、キマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬とプラセボを比較検討する。肝臓組織の解析は、モノクロタリン投与後48時間の時点で肝臓を摘出し、HE染色にて肝細胞の壊死程度をキマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬とプラセボを比較検討する。また、肥満細胞の単位面積あたりの細胞数を定量し、肥満細胞集積に対するキマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬の影響を解析する。マウスにモノクロタリンを投与して作製した肝類洞閉塞症候モデルに対するキマーゼ阻害薬の前投与による影響を継時的に解析したのち、ハムスターで作製したモノクロタリン誘発肝類洞閉塞症候モデルにてキマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬の影響を解析する予定である。
Causes of Carryover	モノクロタリンを投与してマウスの肝類洞閉塞症候モデルを作製したが、想定していたよりも実験の再現性が高かったため、モノクロタリンの経時的な解析を行うのに少ない動物数の検討できた。初年度にマウスで作製したモノクロタリン誘発肝類洞閉塞症候モデルの確立とキマーゼ阻害薬の影響を解析する予定であった。しかし、マウスの肝類洞閉塞症候モデルを作製するのに指摘なモノクロタリン濃度を確立するのに予想外の時間を必要としたため、キマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬による影響を確認することができなかった。そして、結果的に解析する検体数が減り、次年度使用額が生じた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度使用分として、マウスを肝類洞閉塞症候モデルの炎症関連因子の解析としてはTNF-αのみを解析してきたが、インターロイキン-1およびインターロイキン-6などを解析項目に追加したいと考えており、これらの測定費に用いる予定である。また、これらの遺伝子発現は、TaqManプローブを用いたRT-PCRで行いたいと考えており、それらのプライマーおよびプローブ作製の購入費用、そして、ウェスタンブロットのよる蛋白量も測定可能であれば測定する予定にしており、それらに費用を当てる予定である。また、次年度以降はハムスターでモノクロタリン誘発の肝類洞閉塞症候モデルを作製し、そのモデルにおけるキマーゼ阻害薬およびMMP阻害薬の影響を解析する予定であるが、計画時に測定項目に入れていなかったインターロイキン-1およびインターロイキン-6などを次年度使用分で解析する費用としたいと考えている。