2015 Fiscal Year Research-status Report
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26462050
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
林 道廣 大阪医科大学, 医学部, 教授 (90314179)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高井 真司 大阪医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80288703)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 劇症肝炎 / キマーゼ / マトリックスメタロプロテアーゼ / ハムスター / リポポリサッカライド / D-ガラクトサミン / 酸化ストレス / 肝細胞壊死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度は、平成26年度に確立したハムスター劇症肝炎モデルを用いてキマーゼ阻害薬による劇症肝炎に対する予防効果を評価した。
リポポリサッカライド（Escherichia coli, 0111:B4）の160 micro g/kgとD-ガラクトサミンの400 mg/kgの腹腔内投与後２時間において、肝臓組織抽出液中のキマーゼ活性およびキマーゼにより活性化されるマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）-9活性が著明に増加した。また、炎症誘発因子として知られるTumor necrosis factor (TNF)-αもリポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後2時間の時点で著明に増加した。一方、血中のASTおよびALT、そして、肝臓組織中の酸化ストレスマーカーのマロンジアルデヒドは、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後4時間まで投与前と差がなく、24時間になり著明に増加した。また、組織学的解析により、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後24時間で著明な肝細胞壊死を認めた。
キマーゼ阻害薬の投与は、TY-51469の10 mg/kgと30 mg/kgを用いて、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与前１時間の時点で行った。肝臓組織抽出液中のキマーゼ活性、MMP-9活性、TNF-αは、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後2時間に解析した結果、TY-51469の10 mg/kg、30 mg/kgで濃度依存的に抑制された。また、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後24時間の血中のAST、ALTの値、肝臓組織中のマロンジアルデヒド濃度もキマーゼ阻害薬により濃度依存的に抑制され、肝臓壊死面積も有意に減少した。
これらの結果より、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミンので誘発した劇症肝炎モデルに対し、キマーゼ阻害薬は誘発後早期に上昇するキマーゼ活性とMMP-9活性を抑制することにより、炎症増悪を抑制することを介して劇症肝炎を予防することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の目標は、平成26年度に確立したハムスター劇症肝炎モデルを用いてキマーゼ阻害薬による予防効果を解析することであった。ハムスターを用いた劇症肝炎モデルの作製は、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミンを腹腔内に投与して作製した。キマーゼ阻害薬としては、TY-51469の1、3、10、30 mg/kgを用いてリポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与前１時間に投与し、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後2時間で肝臓を摘出し、組織抽出液中のキマーゼ活性を測定した。TY-51469は、3 mg/kgまでこれらの因子に対して抑制傾向を示すものの有意差を認めなかったが、10 mg/kgおよび30 mg/kgの濃度で有意な抑制効果を示した。また、TY-51469の10 mg/kgと30 mg/kgで濃度依存的にキマーゼ活性の阻害作用が強まったことより、これらの用量でキマーゼ阻害薬による影響を検討することにした。
TY-51469の前投与は、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後2時間に著増するMMP-9活性およびTNF-αを濃度依存的に抑制した。これらのことより、キマーゼはMMP-9の活性化を介して炎症を惹起する可能性が強く示唆された。また、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後24時間の時点で増加してくる血中のASTとALTもキマーゼ阻害薬により濃度依存的に抑制され、肝臓組織中マロンジアルデヒドの産生量や肝臓壊死面積も同様に濃度依存的に抑制された。これらのことより、キマーゼ阻害薬の前投与は、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後早期に増加するキマーゼを抑制することで、MMP-9の活性化を抑制し、結果としてTNF-αの発現などの抑制を介して炎症増悪を軽減させたと考えられた。また、この炎症抑制効果が、結果としてリポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後24時間における肝障害の予防に繋がったと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
本ハムスター劇症肝炎モデルに対するキマーゼ阻害薬前投与による予防効果の作用機序を解明するため、生化学的、組織学的に解析する予定である。また、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後2時間の時点からキマーゼ阻害薬を投与することで、炎症惹起後のキマーゼ阻害薬投与による肝障害軽減効果を検証する予定である。
キマーゼ阻害薬前投与による予防効果の機序解明のため、生化学的解析としては、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後2時間の時点で肝臓組織中の炎症関連因子であるTNF-α、インターロイキン-1β、ミエロペルオキシダーゼの遺伝子発現をTaqManプローブ法によるリアルタイムPCRにて定量する予定である。組織学的解析としては、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後24時間の時点で摘出した肝臓組織切片を用いてキマーゼの発現細胞である肥満細胞をトルイジンブルー染色し、キマーゼ発現細胞は抗ハムスターキマーゼ抗体を用いて解析する予定である。
リポポリサッカライドとD-ガラクトサミンによる炎症惹起後のキマーゼ阻害薬投与による肝障害に対する影響を評価する予定である。具体的には、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後2時間ですでにキマーゼ活性、MMP-9活性、TNF-α活性が著増していることより、この時点を炎症惹起が誘発された時点と考え、その時点よりキマーゼ阻害薬であるTY-51469の10 mg/kgと30 mg/kgの投与を行い、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後24時間の血中ASTとALT、肝臓組織中の酸化ストレスの指標であるマロンジアルデヒドや炎症関連因子に対する影響、組織学的解析による肝臓壊死や炎症細胞浸潤に対する影響を評価する予定である。
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| Causes of Carryover |
リポポリサッカライドとD-ガラクトサミンを投与したハムスターの劇症肝炎モデルに対するキマーゼ阻害薬の予防効果を検討するため、キマーゼ阻害薬の濃度として、TY-51469の0.1、0.3、1、3、10 mg/kgをリポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与前1時間に投与し、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後2時間に肝臓組織で著増するキマーゼ活性に対する影響を検討した。これまでに肝疾患（非アルコール性脂肪性肝炎および肝硬変）モデルでは1 mg/kgで有効性を認めていたが、本劇症肝炎モデルでは10 mg/kg以上の濃度でないと有効性を認めず、疾患モデルによって有効濃度が異なることが判明した。この阻害薬使用濃度の決定に時間を費やしたため、当初の予定より解析が遅延して費用が圧縮され、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
キマーゼ阻害薬前投与による劇症肝炎予防効果の機序解明のため、炎症関連因子としてTNF-αに加えてインターロイキン-1およびインターロイキン-6の遺伝子発現の解析、組織学的にも肥満細胞やキマーゼ発現細胞の解析を予定している。これらの遺伝子発現の定量にはTaqManプローブ法に使用するプライマーおよびプローブ作製が必要となり、組織学的解析にも染色用試薬や抗体が必要となり、これらを次年度購入費として使用する。
平成28年度に予定していた費用は、計画通りに本劇症肝炎モデル発症後のキマーゼ阻害薬投与による劇症肝炎予防効果の解析費として使用する予定である。具体的には、リポポリサッカライドとD-ガラクトサミン投与後2時間に10 mg/kgと30 mg/kgの濃度のキマーゼ阻害薬（TY-51469）を投与し、生化学的、組織学的に解析を行う予定である。
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