2014 Fiscal Year Research-status Report

エクソソーム由来microRNA分離と唾液による癌診断および抗癌剤感受性予測

Research Project

Project/Area Number	26462074
Research Institution	Tokyo Medical University
Principal Investigator	砂村眞琴東京医科大学, 医学部, 兼任教授 (10201584)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	杉本昌弘慶應義塾大学, 政策・メディア研究科, 准教授 (30458963) 堀井明東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40249983) 加藤和則東洋大学, 理工学部, 教授 (60233780) 糸井隆夫東京医科大学, 医学部, 准教授 (60338796)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	メタボローム解析 / 代謝物質 / 唾液診断 / 膵癌 / エクソソーム / マイクロRNA
Outline of Annual Research Achievements	唾液を用いたメタボローム解析を行い膵癌のスクリーニング用マーカーの探索を行った。健常者(10例)、慢性膵炎(12例)、膵癌(45症例、StageⅠ:1例、Ⅱ:4例、Ⅲ:7例、Ⅳa:15例、Ⅳb:18例)の唾液中代謝物をCE-TOFMSを用い網羅的に測定した。CE-TOFMSにより唾液中の288代謝物の同定・定量が可能であった。同定されたマーカー用の代謝物質から単一物質のポリアミンに着目した。膵癌切除症例におけるこのポリアミンの濃度は、術前5.37±9.27μM、術後1.54±1.89μMで、11例中８例で低下、２例で上昇、１例は術前・術後も検出されなかった。このポリアミンは細胞増殖に関わる回路で産生される物質であった。 CE-TOFMSを用いて唾液および血液の代謝物質を測定したが、測定値の安定性に問題があった。分担者の杉本はCE-TOFMSのサンプル準備過程や測定手順に関しての検討を行い、新たな測定手順を確立した。この改良により、膵癌Stage1症例からもポリアミン値の上昇が確認でき、膵癌早期診断の可能性が示されたことは特筆に値する。これらバイオマーカーをLC-MSで測定するシステムの確立を進めている。分担者の堀井は、GEM耐性細胞を親株から確立し、CE-TOFMSを用いて細胞内代謝動態を測定した。親株と耐性株との代謝物質を比較し、薬剤感受性を代謝物質から評価する検査法確立を目指している。同様に食道癌細胞株からタキサン耐性株を樹立し検討を開始した。耐性株ではABCトランスポーター（ABCBB1/CD243）が高発現になり、これをsiRNAでノックダウンすると耐性が失われることが判明している。分担者の杉本は、肺癌患者から得られた癌組織を健常組織と比較し、癌組織における代謝の変化を比較検討した。癌組織ではエネルギー代謝が亢進しており、低酸素状態におけるTCAサイクルが逆向きに回転することでエネルギーを得ている状況が確認できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 研究代表者の砂村は本プロジェクトを統括するとともに、膵癌・乳癌・大腸癌・肺癌症例などから唾液・血液・組織を採取し、同時に分担者の糸井と伴に臨床情報の収集を進めた。既にメタボローム解析結果からバイオマーカーが同定され、大規模な臨床試験へとステップアップ出来る準備が完了した。研究分担者の堀井は、膵癌細胞株を用い薬剤耐性株の樹立に成功した。同様に食道癌細胞株からも細胞株が樹立できた。siRNAの手技を用い耐性機序の解明をすすめている。同時にmicroRNAなどとの関連を検索している。研究分担者の杉本は、CE-TOFMSの検体処理法や手技を改良し、測定データの安定性と感度を高めている。その結果、膵癌Stage1症例におけるポリアミンの上昇が感知できるようになった。研究分担者の加藤は、メタボローム解析で同定されたポリアミンに対する抗体作製のプロジェクトを開始した。同時にエクソソーム分離の手技に関しても検討を進めている。
Strategy for Future Research Activity	これまでの研究は癌患者からの唾液採取であった。特徴的なバイオマーカーの感度を検討していく必要があるが、同時に健常者の協力を得て、同定されたバイオマーカーの特異度の検討が必要である。このため、新たな研究班を組織することとした。東京医科大学検診予防センターの協力を得、検診受診者のボランティアから唾液を採取し、健常者の唾液バンクを確立する。既に倫理委員会からの承認を得ている。エクソソームの抽出方法の確立は容易な技術ではないが、研究分担者の加藤が膵癌に特徴的な癌抗原に対する抗体を用い、分離が可能かを検討している。マイクロRNA等による抗癌剤感受性の研究は分担者である堀井が進めており、親株とそこから樹立した耐性細胞株が保有できたことは今後の研究にとって大きなアドバンテージがある。
Causes of Carryover	大規模な臨床試験による測定を予定していたが、測定方法の改良による高精度の手技による測定を用いることとし、収集したサンプルの測定を延期したため試薬の購入が予定より少なかった。また、データの確実性を優先させたために国外などでの研究成果発表を控えたため出張旅費を使用しなかったため予算を使用しなかった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	改良した手順による新たな測定法を用い大規模な臨床試験が開始する。また、ストックしてある収集したサンプルの測定を開始するために試薬の購入を行う。データの正確性が確認できたため、これまでの研究成果を海外などで発表する予定のため出張旅費を使用する。