肺癌におけるErbBfamily受容体からのEMT活性化シグナル標的分子の同定

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462125
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 毛受 暁史 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30527081)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 園部 誠 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00432378)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: アダプター分子 / EGFR / GEP100

Outline of Annual Research Achievements

平成２６年度は、EGF刺激によるGEP100-Arf6活性化を介した癌の浸潤転移能促進経路の詳細なメカニズムを解明する上で、重要な構成分子メカニズムの発見を目標に以下の成果を得ることができた。
１．アダプター分子Grb2のEGFRとGEP100の結合促進に与える影響
我々は、Grb2がGEP100と結合することを２９３T細胞の抗GEP100抗体による免疫沈降実験により確認した。この結合は活性化したEGFRやEGF刺激とは関係なく起こることもわかった。またA549肺癌細胞にてGrb2を過剰発現させた細胞溶解液を用いて、抗GEP100抗体で免疫沈降実験を行った。Grb2の発現量に応じて、EGF刺激を受けた活性化EGFRとGEP100との結合量が増加し、Arf6もより活性化することが示された。GEP100やGrb2の変異型やトランケートしたベクターを用いることで、GEP100とGrb2の結合がGEP100のPHドメインとGrb2のN末SH3およびSH2ドメインを介して行われることが判明した。
２．網羅的結合分子の探索
SILAC法を用いたmass spectromyによる解析を行った。A549、MDA-MB-231細胞を安定同位体アミノ酸を含むもしくは含まない培養液で２週間培養し、EGF刺激を行ったものとスターブしたものを別々に細胞溶解液とし、混合して抗GEP100抗体で免疫沈降を行った。EGF刺激に応じたGEP100結合分子のみがより特異的に検出されると考えた。複数回の解析を行った結果、全てで検出された分子がHsp90betaとABCF1 transporterであった。Hsp90betaは、再構成系による免疫沈降実験でGEP100のPHドメインと結合する可能性が高いことが分かった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

EGF刺激に応じてEGFRとGEP100が結合して、EMTに重要なArf6の活性化を促進する機序の解明において、Grb2がこの二分子の結合を増強することを見出した。現在、学会発表および論文投稿準備中である。また、その他の分子の結合による影響や細胞内環境による結合能の変化については、今後の検討課題である。

Strategy for Future Research Activity

平成２７年度には、EGFRとGEP100、Grb2の３分子複合体について解析をすすめ、学会や論文で発表する。臨床検体によるこれら３分子複合体の重要性を確認したいと考えている。また海外との共同研究を行い、Grb2によるGEP100のallostericな変化によるPHドメインとチロシンリン酸化キナーゼの特異的結合様式を検討する予定である。

Research Products

• [Journal Article] UCHL1 provides diagnostic and antimetastatic strategies due to its deubiquitinating effect on HIF-1α. (2015)
  • Author(s): Goto Y, Zeng L, Yeom CJ, Zhu Y, Morinibu A, Shinomiya K, Kobayashi M, Hirota K, Itasaka S, Yoshimura M, Tanimoto K, Torii M, Sowa T, Menju T, Sonobe M, Kakeya H, Toi M, Date H, Hammond EM, Hiraoka M, Harada H.
  • Journal Title: UCHL1 provides diagnostic and antimetastatic strategies due to its deubiquitinating effect on HIF-1α. Volume: Jan 23;6 Pages: 6153
  • DOI: 10.1038/ncomms7153.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genes suppressed by DNA methylation in non-small cell lung cancer reveal the epigenetics of epithelial-mesenchymal transition. (2014)
  • Author(s): Lin SH, Wang J, Saintigny P, Wu CC, Giri U, Zhang J, Menju T, Diao L, Byers L, Weinstein JN, Coombes KR, Girard L, Komaki R, Wistuba II, Date H, Minna JD, Heymach JV.
  • Journal Title: BMC Genomics Volume: Dec 8;15 Pages: 1079
  • DOI: 10.1186/1471-2164-15-1079.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Indentification of subsets of patients with favorable prognosis after recurrence in completely resected non-small cell lung cancer. (2014)
  • Author(s): 335.Sonobe M, Yamada T, Sato M, Menju T, Aoyama A, Sato T, Chen F, Omasa M, Bando T, Date H.
  • Journal Title: Ann Surg Oncol Volume: 21(8) Pages: 2546-54
  • Peer Reviewed / Open Access