悪性グリオーマ幹細胞におけるWT1とALCAMの機能的役割と血管新生への関与

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462180
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 橋本 直哉 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90315945)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 坪井 昭博 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座教授 (10372608) ; 千葉 泰良 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立母子保健総合医療センター(研究所), その他部局, 脳神経外科・医長 (90533795) ; 永野 大輔 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (70726520) ; 高野 浩司 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (90649203) ; 福屋 章悟 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (50726502)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ALCAM/sALCAM / WT1 / 腫瘍血管新生能 / 腫瘍形成能

Outline of Annual Research Achievements

ALCAM(Activated leukocyte cell adhesion molecule)とWT1 (Wilms’ Tumor 1)を基軸として、グリオーマ幹細胞／グリオーマ細胞における機能的役割や血管新生との関連を明らかにし、新たな治療法を開発することを目的に、研究計画書に基づき以下の研究を継続し、一定の成果を得た。
A: 悪性グリオーマ幹細胞におけるWT1遺伝子産物の機能的役割の検討：臨床検体における初期培養腫瘍細胞からtumor sphereを作成し、WT1をknock downし、in vitroでの分化能の相違を検討した。また、免疫不全マウスにこれらの細胞を移植した時の腫瘍形成能を検討し、一定の成果を得た。
B: 悪性グリオーマ血管新生におけるWT1とALCAM / sALCAMの機能的役割の解明： In vitroでのtube formation assay、in vivoでの腫瘍血管内皮細胞の検討から、2つの分子は腫瘍血管新生に重要な役割を担っている結果が示された。
C: 悪性グリオーマ幹細胞のperivascular nicheにおけるWT1とALCAMの機能的役割の解明　CD133(+)ALCAM(+)WT1(+)とWT1(－)の腫瘍細胞を、血管内皮細胞と共培養し、tube formationの違いを検討した。WT１も腫瘍血管新生に重要な役割を担うことが判明した。In vivoで、腫瘍細胞を①単独群、②＋controlの血管内皮細胞投与群、③＋ALCAM knock down血管内皮細胞投与群、④＋WT1 knock down血管内皮細胞投与群に分けて免疫不全マウスに投与し、検討を開始した。
D: sALCAMに対するblocking antibodyの作成とその効果の検討：sALCAMに対する抗体の作成を、ハイブリドーマによる抗体精製法を用いて開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

A: 悪性グリオーマ幹細胞におけるWT1遺伝子産物の機能的役割の検討、B: 悪性グリオーマ血管新生におけるWT1とALCAM / sALCAMの機能的役割の解明、C: 悪性グリオーマ幹細胞のperivascular nicheにおけるWT1とALCAMの機能的役割の解明、D: sALCAMに対するblocking antibodyの作成とその効果の検討において、あらかじめ予測された一定の成果を得た。sALCAMに対する抗体作成は、やや進捗が遅延気味であるが、今後の方向性は当初の予定通り、変更せずに遂行できると考える。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度までにA: 悪性グリオーマ幹細胞におけるWT1遺伝子産物の機能的役割の検討およびB: 悪性グリオーマ血管新生におけるWT1とALCAM / sALCAMの機能的役割の解明、については一通りの結果を得ている。平成28年度は、引き続き、CとDの実験を継続する。
C: 悪性グリオーマ幹細胞のperivascular nicheにおけるWT1とALCAMの機能的役割の解明：平成27年度に開始したマウス腫瘍モデルにおける腫瘍形成能の解析について、再現実験を行い、WT1とALCAMの腫瘍形成能の差異を明確にする。
D: sALCAMに対するblocking antibodyの作成とその効果の検討：sALCAMの抗体精製を完了させ、それを用いて、matrigel invasion assayおよびラット/マウスの正常脳を使用したbrain slice cultureにて、浸潤能が抗体使用群で変化するか検討する。浸潤能に相違が認められた場合、gelatin zymographyを行いmetalloproteinaseの活性の変化を検討する。In vivoでは、悪性グリオーマ標本から採取した腫瘍細胞や細胞株を免疫不全マウスへ投与する。それぞれの細胞種で投与後抗体使用群とコントロール群にランダムに分け、腫瘍形成及びマウスの生存期間に差が生じるかどうかの検討を行う。形成された腫瘍組織の組織学的検討を行い、腫瘍形成能の差異及び浸潤の抑制、さらには腫瘍血管新生に変化が起こっているかどうかを解析する。形成された腫瘍組織から得た腫瘍細胞のsphere形成能及び各種幹細胞マーカー発現の差異についても検討する。
研究の最終年度であり、AからDで得られた結果を網羅的に比較検討し、必要があれば統計的解析を加えて、英文論文として投稿、発表を行う。

Causes of Carryover

A: 悪性グリオーマ幹細胞におけるWT1遺伝子産物の機能的役割の検討、B: 悪性グリオーマ血管新生におけるWT1とALCAM / sALCAMの機能的役割の解明、C: 悪性グリオーマ幹細胞のperivascular nicheにおけるWT1とALCAMの機能的役割の解明、D: sALCAMに対するblocking antibodyの作成とその効果の検討 の４つの研究を同時並行的に進めており、またそれぞれは密接に関連するため、進行状況に若干の差異を認めた。また、これらは平成28年度も継続して行う予定のため、継続性を重視し、若干の残額が生じることとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

A, Bはほぼ実験を完了しており、C: 悪性グリオーマ幹細胞のperivascular nicheにおけるWT1とALCAMの機能的役割の解明、D: sALCAMに対するblocking antibodyの作成とその効果の検討についての研究経費として、残額を使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Direct microsurgical embolectomy for acute occlusion of the internal carotid artery and middle cerebral artery. (2016)
  • Author(s): Hino A, Oka H, Hashimoto Y, Echigo T, Koseki H, Fujii A, Katsumori T, ShiomiN, Nozaki K, Arima H, Hashimoto N.
  • Journal Title: World Neurosurg Volume: 88 Pages: 243-251
  • DOI: 10.1016/j.wneu.2015.12.069.
• [Journal Article] Prognostic value of medulloblastoma extent of resection after accounting for molecular subgroup: a retrospective integrated clinical and molecular analysis. (2016)
  • Author(s): Thompson EM, Hielscher T, Bouffet E, Remke M, Luu B, Gururangan S, Hashimoto N, Ramaswamy V, Taylor MD, et al.,
  • Journal Title: Lancet Oncol Volume: Mar 11 Pages: Epub ahead
  • DOI: 10.1016/S1470-2045(15)00581-1.
  • Int'l Joint Research
• [Journal Article] Immunotherapy response assessment in neuro-oncology: a report of the RANO working group. (2015)
  • Author(s): Okada H, Weller M, Huang R, Finocchiaro G, Gilbert MR, Wick W, Ellingson BM, Hashimoto N, Pollack IF, Brandes AA, Franceschi E, Herold-Mende C, Nayak L, Panigrahy A, Pope WB, Prins R, Sampson JH, Wen PY, Reardon DA.
  • Journal Title: Lancet Oncol. Volume: 16 Pages: e534-42
  • DOI: 10.1016/S1470-2045(15)00088-1.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] WT1 peptide vaccination for glioblastomas; survivals, biomarkers, and response assessment (2016)
  • Author(s): Naoya Hashimoto, Akihito Tsuboi,Toshiki Yoshimine, Haruo Sugiyama
  • Organizer: ICBTRT 2016
  • Place of Presentation: 沖縄
  • Year and Date: 2016-04-10 – 2016-04-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 神経膠腫に対するWT1ペプチドワクチン療法の新展開 (2015)
  • Author(s): 橋本直哉, 坪井昭博, 香川尚己, 千葉泰良, 木下 学, 木嶋教行, 有田英之, 平山龍一, 永野大輔, 高野浩二, 福屋章悟, 福永貴典, 岡 芳弘, 尾路祐介, 杉山治夫,吉峰俊樹
  • Organizer: 第74回日本脳神経外科学会総会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2015-10-14 – 2015-10-16
• [Book] 脳神経外科学 (2016)
  • Author(s): 橋本直哉 監修 太田富雄
  • Total Pages: 2870
  • Publisher: 金芳堂