2014 Fiscal Year Research-status Report
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26462230
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
若林 良明 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 非常勤講師 (00431916)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
榎本 光裕 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (90451971)
早乙女 進一 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (20401391)
大川 淳 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30251507)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 神経科学 / 脳・神経、脳神経疾患 / 再生医学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画では、末梢神経損傷モデルを使用し、神経筋接合部（NMJ）の変性保護に注目し、神経損傷における神経再生ならびに拘縮予防の新規治療法の開発を目指すものである。
今年度は、腓骨神経切断モデルの作製と切断後の前脛骨筋内NMJの評価および運動機能の変化を解析した。野生型マウスを用いて腓骨神経を露出させ分岐部で切断するモデルである。神経切断後は、前脛骨筋萎縮が経時的に進行していく。切断後、1週、2週、3週と経時的に運動機能を解析し、前脛骨筋を組織学的に評価した。運動機能テストには、ポータブルビデオで撮影した足底の荷重面、足趾の開きを計測してperoneal functional index (PFI)を算出した。さらに両足圧力差痛覚測定機器を用いて切断側の荷重を測定した。その結果、PFIは切断後低下したままで運動機能の回復はなかった。一方、後肢荷重は切断後2週で低下し、3週で回復傾向にあった。神経線維(NF)とNMJをラベルするボツリヌス毒素（BTX）を用いた免疫組織学解析では、切断2週でBTX陽性数が一時的に増加していた。NFとBTX共陽性のNMJ数は、切断1週、2週で共陽性が観察されなかったのに対し、3週時のNMJでは一部観察された。また、ミエリンを形成するシュワン細胞のマーカーであるS100で免疫染色すると切断1、2週では染色性の低下が見られたが、3週ではやや増加していた。このことから切断3週後に観察された部分的な後肢荷重が、痛みの軽減効果だけでなく前脛骨筋の神経筋接合部での神経再支配が原因である可能性が示唆された。今後は、損傷3週以降のマウスを用いてNMJの再神経支配に注目して同様に解析を進め、分子生物学的に萎縮筋に発現する神経栄養因子やサイトカインの定量を行っていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
動物実験施設の改修があって動物実験の進行が遅れた。また、神経筋接合部を構成する神経線維の同定に時間を要した。しかし、野生型マウスを用いてニューロフィラメントM抗体を使用することで神経線維と神経筋接合部を同定することが可能となり、組織切片で同部の変性および神経再支配様式についてある程度観察できた。組織切片を一定のスライス方向で作製することで定量評価も可能となった。また、運動機能評価に両足圧力差痛覚測定機器を追加することで組織所見との関連性が得られた。おおむね順調に進展しているが、初年度計画にあったThy1-YFPトランスジェニックマウスを購入したものの年度内での解析は困難であった。同マウスは、免疫染色しなくても運動神経を蛍光顕微鏡で容易に同定可能となっている。次年度、同マウスの腓骨神経切断実験によって神経変性の程度や再支配の評価を行った後に神経筋接合部の保護効果について実験を進めていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度、腓骨神経切断後の後肢運動機能と組織学的関連を明らかにすることはできたが、萎縮前脛骨筋に対する電気生理学的評価は未施行であった。神経再支配と筋張力について経時的に明らかにし、今後の治療評価項目として確立したい。また、経時的に萎縮筋での神経栄養因子分泌とサイトカインの発現解析を行って筋萎縮に伴うNMJの影響についても検索する。当初の研究計画にあるようにグリア細胞由来神経栄養因子GDNFあるいはL型Caチャネル作用薬（BayK8644）を筋内に投与して同薬剤による神経筋接合部の保護効果を確認する。また、萎縮筋の再生を観察するには、遊離神経移植を行って切断腓骨神経の再建を行う必要がある。再建時に薬剤投与をすることで薬剤の有効性や作用機序を解明することができると予想している。特にNMJを構成しているシュワン細胞の機能に注目しており、神経変性後の増殖活性や再髄鞘化についても解析を進めたい。
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| Causes of Carryover |
動物実験施設の改修があったため十分な動物実験が施行できなかった。そのため組織や分子生物学的解析に使用する消耗品も少なかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度は、遺伝子改変マウスを使用した動物実験が中心となる。動物実験施設におけるマウス購入および飼育費用がかかる。組織染色には、HE染色などの一般的な染色液のほかに神経および筋細胞に特異的に反応する抗体が解析に必要であり、同部位を可視化するには蛍光標識付きの二次抗体が必要である。遺伝子発現など分子生物学的解析には試薬が必要であり、適宜購入が必要である。昨年度まとめたデータについては積極的に学会発表を行い、研究計画を遂行することでデータを追加し論文として成果をまとめる。
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