骨髄間葉系幹細胞移植した同種脱細胞化神経片含有血管柄入りチューブ内での神経再生

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462240
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 柿木 良介 近畿大学, 医学部, 教授 (20314198)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 赤木 將男 近畿大学, 医学部, 教授 (00273441) ; 松田 秀一 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40294938) ; 太田 壮一 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70592484)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 末梢神経再生 / 骨髄幹細胞 / 血管茎 / 同種神経基底膜移植

Outline of Annual Research Achievements

これまでに我々は、このチューブ内環境に骨髄間葉系幹細胞を移植すれば、細胞はその豊富な血流と神経因子により、神経系細胞に分化、増殖し、神経再生を促進させる事を報告した(T. Yamakawa et al. Cell transplant 2007)。本実験では、我々は移植細胞がチューブ内で滞在するための足場として、同種神経基底膜を神経チューブ内に移植する事により、より末梢神経再生が促進されるのでは無いかという仮説を立て、この実験を行っている。
同種神経基底膜としては、DA ratより採取した坐骨神経にfreeze and throwを繰り返す事により細胞成分を除去した同種神経基底膜を作成した。Lewis ratの坐骨神経に作成された20mmの神経欠損を、腓腹動静脈茎と骨髄間葉系幹細胞(BMSC)移植した同種神経基底膜を含有したシリコンチューブで架橋した群(VCS群)、コントロールとして同種神経基底膜の入ってない骨髄幹細胞移植血管含有チューブで架橋した群(VC群)をそれぞれ20頭作成し、その神経再生を、術後12週に電気生理学的、組織形態学的に各群10頭ずつに対して評価を行った。その結果VCS群、VC群の運動神経伝導速度は、対側正常肢のそれぞれ50.3±16.7%、38.3±23.8%で、両群間に有為さはなかったが、母趾内転筋のM波の振幅は、それぞれ対側正常肢の10.1±6.4%, 3.6±2.5%で有為にVCS群の振幅が大きかった。また神経チューブ遠位部より採取した再生神経横断面での形態学的検索では、VCS群、VC群の平均有髄神経軸索総数は、それぞれ3370±1253, 852±435、平均有髄神経軸索直径は、それぞれ3.47±0.37μ, 2.89±0.36μで、平均有髄神経軸索総数、平均有髄神経軸索直径とも有為にVCS群が優れていた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ほぼ予定通りに進行しているから

Strategy for Future Research Activity

1. 電気生理学的、組織形態学的検索：平成27年5月に、術後24週間後のVCS, VC群のラットを屠殺し、電気生理学的検索と組織形態学的検索を行う。
2. 移植BMSCのSchwann cell様細胞への分化に関する検討：神経チューブ内に移植したBMSCが、Schwann細胞様に分化しているかを検索するため、GFP Lewis ratより採取したBMSCを普通のLewis ratの神経チューブ内に移植し、再生神経切片をS100, GFAPで免疫染色をおこない、GFPの信号とmergeする細胞があるか検索する。
3. 同種神経基底膜の細胞外マトリックスの存在に対する検索：我々が作成した同種神経基底膜にextra cellular componentであるlaminineが残存しているか抗laminine抗体を用いて検索する。
4. 同種神経基底膜の抗原性についての検索：移植された同種神経移植片に拒絶反応が起こっていないかを調べるため、CD8a monoclonal antibodyを用いて免疫染色行い、VCS群の再生神経片、自家神経移植片、同種神経移植片と比較検討する。
5. 同種神経基底膜の血行化についての検索：本実験では、20mmの坐骨神経欠損を架橋しており、長い神経チューブ中央部では、虚血になることが予想される。虚血状態では、移植したBMSCも死滅する可能性があるため、本実験では腓腹動静脈の血管茎をチューブ内に挿入している。実際に挿入した血管茎よりその側に移植された同種神経基底膜が血行化されているかを、anti-rat endothelial cell cytoplasmic antigen (RECA-1) antibodyを用いた免疫染色を行い検討する。

Causes of Carryover

動物購入、飼育、標本作製に関しては、教室からの研究費を一部使用した。また平成27年度からは免疫染色等で、抗体など高価な薬品を購入する必要があり、研究費不足が予測される．その不足分に昨年度研究費の一部を充填する予定である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成26年度に残した研究費は、抗体の購入に使う予定である。抗S100, 抗GFAP抗体、抗laminine抗体、CD8a monoclonal antibody、anti-rat endothelial cell cytoplasmic antigen (RECA-1) antibody等の抗体およびGFP ratの購入に研究費を使用する予定である。研究費の不足分は、大学、教室からの研究費を充当する予定である。