Investigation of minimum invasive fusion surgery using injection of novel induced pluripotent stem cells cell

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26462246
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 鈴木 亨暢 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (00445016)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺井 秀富 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20382046) ; 中村 博亮 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (60227931)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: iPS細胞 / ヒト人工多能性幹細胞 / BMP遺伝子 / 骨形成タンパク / HSV-TK遺伝子 / 単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ / 低侵襲脊椎固定術

Outline of Annual Research Achievements

当研究は、骨形成タンパク-2 (Bone Morphogenetic Protein-2; BMP-2)、及び、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ（HSV-TK）発現プラスミドベクターを導入したiPS細胞を作製し、同細胞の骨形成能、及び、ガンシクロビル（GCV）の添加により発現ベクター導入細胞の細胞死を確認した後に、ラットを用いて細胞注射による脊椎固定術の検証を行うことを目的とし、平成26年度より開始されている研究である。
平成27年度までに、BMP-2遺伝子とHSV-TK遺伝子をIRESでつないだプラスミドを作成、GFP遺伝子を持つベクターにクローニングしプラスミドベクターを作成した。作成したプラスミドベクターを、マウス横紋筋由来細胞（C2C12細胞）にLipofection法にてトランスフェクションし機能評価を行った。導入効率は80％と高水準であり、GCV共培養による細胞死も安定して確認されたが、ALP活性で評価したBMP-2機能評価のみが不安定な結果である点が問題であった。
平成28年度は、ベクターによりBMP-2が産生されているかを直接検証する目的で、ELISA法にてBMP-2の定量評価を行った。結果、ベクターを導入したC2C12細胞はBMP-2を産生（10ng/ml）しているが、C2C12の骨分化誘導を行う域値（50ng/ml）に達していないことが判明した。またBMP-2の検証作業と同時に、トランスフェクションに適したiPS細胞の分化ステージに関する検討を始めた。
以上をまとめると、本研究期間中にBMP-2およびHSV－TKを発現する新たなプラスミドの作成に成功した。プラスミドの導入にて、GCV投与による細胞死、及び、BMP-2の発現は確認されたが、発現タンパクの濃度を高めることが課題と判明した。今後は、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入を行う予定である。